白念珠菌高鐵還原酶FRP1基因與Rim101蛋白相互作用的研究.pdf

1、白念珠菌是念珠菌病原體中最常見(jiàn)的一種條件性致病菌,白念珠菌應(yīng)答的-個(gè)主要環(huán)境因素為細(xì)胞外的pH,這種應(yīng)答反應(yīng)是由保守的真菌信號(hào)傳導(dǎo)途徑RIM101途徑所控制,許多依賴pH表達(dá)的基因受轉(zhuǎn)錄因子Rim101蛋白所調(diào)控。從宿主中獲得鐵的能力對(duì)于白念珠菌的定居和存活是必需的。白念珠菌鐵獲得系統(tǒng)的調(diào)控對(duì)其生存和毒力非常重要,而細(xì)胞外的不同pH條件影響著鐵離子的生物可利用率,因此推測(cè)鐵獲得系統(tǒng)受轉(zhuǎn)錄因子Rim101蛋白調(diào)控。 通過(guò)對(duì)白念珠菌

2、高鐵還原酶基因FRP1啟動(dòng)子進(jìn)行突變分析,確認(rèn)啟動(dòng)子中特殊調(diào)控元件。DNA微陣列結(jié)果顯示FRP1表達(dá)受Rim101蛋白調(diào)控。我們通過(guò)分析FRP1起始密碼子上游1K序列發(fā)現(xiàn)在-160和-650處有兩個(gè)推測(cè)的Rim101p結(jié)合位點(diǎn),對(duì)其分別進(jìn)行定點(diǎn)突變,然后構(gòu)建啟動(dòng)子與報(bào)告基因1acZ融合質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化整合到白念珠菌,rim101-/-株和野生株中,檢測(cè)不同缺鐵條件下β-半乳糖苷酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)堿性條件,Rim101p能夠正向調(diào)控FRP1的表達(dá)

3、：?jiǎn)?dòng)子-160處突變對(duì)啟動(dòng)子功能影響較弱,而-650突變使啟動(dòng)子活性大大降低,此結(jié)果和雙突變的結(jié)果相同,表明Rim101p主要通過(guò)與啟動(dòng)子-650處結(jié)合位點(diǎn)相互作用來(lái)調(diào)控FRP1的表達(dá)。 為了驗(yàn)證Rim101p是否直接結(jié)合GCCAAG位點(diǎn),利用白念珠菌細(xì)胞總蛋白提取物進(jìn)行EMSAs實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Rim101p能直接與-160和-650探針結(jié)合,不同的培養(yǎng)條件(pH)不影響結(jié)合。將全長(zhǎng)Rim101p和截短Rim101p分別在大腸桿菌中

4、成功表達(dá),重組蛋白EMSAs實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證Rim101p能直接結(jié)合GCCAAG位點(diǎn)。并且發(fā)現(xiàn)截短Rim101p只能與-650探針結(jié)合,說(shuō)明截短(活性形式)Rim101p主要通過(guò)與啟動(dòng)子-650位點(diǎn)結(jié)合調(diào)控FRP1表達(dá),這與啟動(dòng)子突變結(jié)果一致。 為了尋找FRP1上游-822～-437和-263～124片斷中的特殊調(diào)控元件,本實(shí)驗(yàn)分別將片段與IMH3中性啟動(dòng)子連接,通過(guò)β-半乳糖苷酶活性的分析說(shuō)明：-822～-437區(qū)域有促進(jìn)啟動(dòng)子