fcm原理及臨床應(yīng)用(新)(1)課件

1、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)原理及在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry FCM)是利用流式細(xì)胞儀對(duì)單個(gè)生物顆粒(紅細(xì)胞、白細(xì)胞、各類組織細(xì)胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和生物學(xué)特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析，并能對(duì)特定細(xì)胞群體加以分選的分析技術(shù)。,流式細(xì)胞術(shù)的概念,FCM的工作原理,流式細(xì)胞儀組成：1.液流系統(tǒng)2.光學(xué)系統(tǒng)3.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),1.液流系統(tǒng)：由樣本和鞘液組成。待測(cè)細(xì)胞被制備成單個(gè)細(xì)胞的懸液，經(jīng)熒光

2、染料標(biāo)記的McAb染色后置入樣品管中，在清潔氣體壓力下進(jìn)入流動(dòng)室形成樣本流。在鞘液 (sheath)的約束下，通過(guò)噴嘴，使其形成單細(xì)胞液柱。,,,Flow Cell,鞘液：輔助樣本流能被正常檢測(cè)的基質(zhì)液作用： 1.包裹在樣本流的周圍，使其處于噴嘴中心，以保證檢測(cè)的精確性； 2.防止樣本流中的細(xì)胞靠近噴孔壁而堵塞噴孔。,2.光學(xué)系統(tǒng)：由激發(fā)光源、分光鏡、光束成形器等組成。激光是較常用的光源, 穩(wěn)定性好、單色性好。

3、檢測(cè)信號(hào)： 散射光和熒光信號(hào)被收集、處理、轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)。,,FCM檢測(cè)信號(hào),散射光信號(hào) 前向散射光（foword scatter, FS）：在激光束正前方的檢測(cè)器，用于檢測(cè)細(xì)胞或其他粒子物體的表面屬性，如大小、形狀等。反映細(xì)胞顆粒的大小。 側(cè)向散射光（side scatter， SS）：與激光束垂直方向的檢測(cè)器為側(cè)向檢測(cè)器，主要用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性，可獲得細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的參數(shù)。反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程

4、度、表面的光滑程度。熒光信號(hào) (反映被染上熒光的細(xì)胞數(shù)量多少）,熒光信號(hào),每種熒光染料都有特定的激發(fā)波長(zhǎng)，受激光激發(fā)后會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色，如綠色、紅色、黃色等。流式細(xì)胞儀就是利用不同波長(zhǎng)的光學(xué)濾片來(lái)檢測(cè)這些特定發(fā)射波長(zhǎng)的光學(xué)信號(hào)。熒光信號(hào)反映被染上熒光的細(xì)胞數(shù)量多少。,3.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：主要由計(jì)算機(jī)及其軟件組成。 通過(guò)檢測(cè)散射光及熒光信號(hào)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析存儲(chǔ)、顯示。具有智能化、自動(dòng)化特點(diǎn)。,免疫熒光標(biāo)記,直接免疫

5、熒光染色法：選用熒光標(biāo)記的McAb是直接針對(duì)細(xì)胞表面抗原特異性標(biāo)志的單一抗體,如抗CD3-FITC抗體、抗CD4-PE抗體、抗CD8-PeCy5抗體。間接免疫熒光染色法：選用特異性McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合后，再用熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行染色。雙標(biāo)記或多標(biāo)記分析：目前使用的流式細(xì)胞儀能用一個(gè)激光束激發(fā)檢測(cè)三色甚至四色熒光信號(hào)。檢測(cè)時(shí)需注意熒光補(bǔ)償。,常用免疫熒光染料組合,熒光補(bǔ)償： 每?jī)煞N熒光信號(hào)間不可避免會(huì)出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，重疊區(qū)越大

6、，信號(hào)檢測(cè)的準(zhǔn)確性就越差，因此需計(jì)算機(jī)工作軟件進(jìn)行自動(dòng)跟蹤調(diào)節(jié)補(bǔ)償。,流式細(xì)胞儀的基本功能細(xì)胞表型分析(包括細(xì)胞膜、胞漿內(nèi)蛋白表達(dá)及核膜成份分析DNA含量及細(xì)胞周期分析：DNA content analysis，如細(xì)胞凋亡檢測(cè)細(xì)胞分選 cell sorting自身免疫性疾病相關(guān)HLA抗原分析、自身抗體的檢測(cè)：如用Hep-2細(xì)胞檢測(cè)抗核抗體。,臨床免疫學(xué) 臨床血液學(xué) 臨床腫瘤學(xué) 血栓與止血 骨髓和器官移植

7、 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究,流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用,FCM在臨床免疫學(xué)中的應(yīng)用(1) 淋巴細(xì)胞亞群分析 T細(xì)胞： CD3+ CD4+ (Th) CD8+ (Ts/Tc) B細(xì)胞： CD19+ NK細(xì)胞： CD3- CD16+ CD56+,(2) 淋巴細(xì)胞亞群細(xì)分 T細(xì)胞：Ts：CD8+ CD2

8、8- Tc：CD8+ CD28+ Th：CD4+ CD29+ B細(xì)胞：B1：CD5+ CD19- B2：CD5 + CD19+,根據(jù)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的不同還可將CD4+、CD8+分為 ? CD4+: Th1: CD4+ IFN-r+

9、 Th2: CD4+ IL4+ Th0: CD4+ IFN-r+ IL4+ ? CD8+: Tc1: CD8+ IFN-r+ Tc2: CD8+ IL4+

10、 Tc0: CD8+ IFN-r+ IL4+,輔助性T細(xì)胞亞群的生物學(xué)功能及臨床意義Th1細(xì)胞：介導(dǎo)細(xì)胞免疫、細(xì)胞毒性T細(xì)胞的生長(zhǎng)和活化、巨噬細(xì)胞的活化、介導(dǎo)遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)。其功能亢進(jìn)將導(dǎo)致炎癥慢性遷延，器官特異性自身免疫病，急性排異反應(yīng)和接觸性皮炎等的發(fā)病和免疫病理?yè)p傷。Th2細(xì)胞 ：介導(dǎo)體液免疫，促進(jìn)B細(xì)胞的生長(zhǎng)、活化和分化，是IgG1和IgE類抗體的轉(zhuǎn)換因子，其

11、功能亢進(jìn)將導(dǎo)致特異性過(guò)敏反應(yīng)，參與高IgE綜合癥和嗜酸性粒細(xì)胞增多癥。,(3) 活化淋巴細(xì)胞亞群 活化總T細(xì)胞： CD3+ /HLA—DR+ 靜止總T細(xì)胞： CD3+ /HLA—DR- 活化CD4+細(xì)胞：CD4+ /HLA—DR+ 活化CD8+細(xì)胞：CD8+ /HLA—DR+ 活化誘導(dǎo)分子： CD69 白細(xì)胞介素2低親和力受體： CD25 CD25+ /CD3+：活化T細(xì)胞 CD25-

12、 /CD3+：靜止T細(xì)胞,(4) 淋巴細(xì)胞功能分析：細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒試驗(yàn)、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的測(cè)定 自身免疫性疾病 變態(tài)反應(yīng)性疾病 免疫缺陷性疾病 感染性疾病(病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)感染) 免疫治療監(jiān)測(cè) 腫瘤免疫監(jiān)測(cè) 移植免疫監(jiān)測(cè),(二) FCM在臨床血液學(xué)中的應(yīng)用1.白血病的MIC分型 Morphology（形態(tài)學(xué)） Immunology（免疫學(xué)） Cytogenetics（細(xì)胞遺傳學(xué)）

13、白血病分型是選擇化療方案和判斷預(yù)后的重要依據(jù)。白血病免疫分型是MIC分型的重要組成部分，也是對(duì)FAB分型的補(bǔ)充，對(duì)白血病的診斷、治療策略制定、預(yù)后判斷及對(duì)白血病發(fā)病機(jī)制的研究都具有重要作用。,免疫分型的臨床意義,? 彌補(bǔ)FAB分型的不足 ? 診斷其他血液系統(tǒng)腫瘤 ? 診斷僅表達(dá)個(gè)別非本系列相關(guān)抗原的急性 白血病（LY+—AML、MY+—ALL） ? 急性雙系或雙表型白血病的診斷 ? 骨髓增生異常綜合征（MDS）

14、免疫表型分析的臨床意義 ? 免疫分型對(duì)鑒別慢性淋巴細(xì)胞增生性疾病各亞型亦有肯定的診斷價(jià)值,以下為各系列較特別的標(biāo)志： AML： MPO、 CD33、 CDl3、 CDl4 CDl5、 CDllb、 CDllc T-ALL： c／mCD3、 CD2、 CD5、 CD7、 CD4／CD8、 CD38 B-ALL： cCD22、cCD79、 CDl9、 CDl0、 CD24、 HLA—DR、 CD20、

15、 CD38 造血干／祖細(xì)胞: CD34、 CDll7、 CD38、 HLA-DR、 ACl33,在AML各亞型的免疫分型中有時(shí)仍較難分辨，有以下特點(diǎn)可供參考： ①CD41、CD61是巨核細(xì)胞的標(biāo)志，見(jiàn)于FAB—M7，但 血小板粘附于某細(xì)胞上可造成假陽(yáng)性。 ② CD71與血型糖蛋白是紅系的標(biāo)志，見(jiàn)于FAB—M6型。 ③ CDl4、 CD64是單核細(xì)胞的標(biāo)志，見(jiàn)于M4或M5。

16、 ④ FAB—M3，t(15；17)者典型的免疫表型是CDl3+、 CD33+、 CD9+、 CD38+、 CD34-、 DR-。 ⑤ t(8；21)M2的表型為 CDl3+、 DR+、 CD34+、 CD33+、 CDl5+、 CDl9+或CD56+。 ⑥ M0與M1較難區(qū)分，應(yīng)有髓系標(biāo)志而無(wú)淋系標(biāo)志，胞漿MPO應(yīng)陰性。 CD34及DR在M0較強(qiáng)，并可伴有CD7與CD4。,⑦ CDll7+多見(jiàn)于AML。 ⑧ CD7常

17、與CD34共表達(dá)， CD4見(jiàn)于M4、M5。 CD2+見(jiàn)于M4Eo，往往伴有16號(hào)染色體異常。 M3亦可有 CD56+表達(dá)。正常粒細(xì)跑可表達(dá) CDl0。由此可見(jiàn)，單抗本身有其多向性，勿輕易判斷為雜合型白血病。 ⑨ T／B—ALL可分為幾個(gè)亞型，然而對(duì)臨床價(jià)值不大。但若B—ALL伴有CD34表達(dá)時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步作遺傳學(xué)與基因檢測(cè)，以確定是否是Ph+ALL，不論是M—bcl/abl或m-bcr／ablmRNA陽(yáng)性者，其預(yù)后均較差，應(yīng)接受大劑

18、量化療或早期接受異基因骨髓移植。,FCM檢測(cè)白血病微小殘留病變(MRD): 過(guò)去認(rèn)為 FCM測(cè)定殘存白血病細(xì)胞不可靠，因?yàn)楝F(xiàn)用的 McAb不能鑒別正常血細(xì)胞與白血病細(xì)胞。雖然至今尚未發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞特異抗原，但近來(lái)有人提出根據(jù)白血病細(xì)胞的以下特征， FCM檢測(cè)的敏感度可明顯提高,白血病細(xì)胞的某些抗原表達(dá)量明顯高于相應(yīng)的正常血細(xì)胞 如小兒ALL，其CDl0+細(xì)胞的熒光強(qiáng)度可高達(dá)3-4個(gè)對(duì)數(shù)值，而其 CD45則為弱陽(yáng)性或陰性

19、。相應(yīng)正常細(xì)胞 CDl0+的細(xì)胞熒光強(qiáng)度約為2個(gè)對(duì)數(shù)值， CD45為陽(yáng)性。若能定量則更可靠。,FCM在臨床腫瘤學(xué)中的應(yīng)用1.血液標(biāo)本的檢查 腫瘤患者的免疫功能檢查 腫瘤患者的粘附分子檢查ICAM-1 CD54ICAM-2 CD102ICAM-3 CD106CD62、CD63、CD42a/b、CD41/61、TSP,(2) 腫瘤實(shí)體標(biāo)本的FCM檢查 耐藥基因檢查 粘附分子檢查

20、 細(xì)胞凋亡檢查 細(xì)胞DNA分析 增殖性核抗原 腫瘤細(xì)胞耐藥性篩選 腫瘤相關(guān)抗原 激素受體 與癌細(xì)胞生物行為有關(guān)的因子，如CD44,組織標(biāo)本的正確處理： 去除脂肪、結(jié)締組織 洗滌除去紅細(xì)胞 用眼科剪剪成肉糜狀 用250至350目的銅網(wǎng)過(guò)濾要求： 細(xì)胞碎片、細(xì)胞連片少，單細(xì)胞要多,利用特殊的熒光染料(PI、EB、AO等) 與細(xì)胞內(nèi)DNA堿基結(jié)合，被這些熒光染料染色的細(xì)胞在激光

21、照射下發(fā)射出熒光，熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。流式細(xì)胞儀通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度推算出細(xì)胞的DNA含量。,細(xì)胞DNA分析原理,細(xì)胞周期與DNA的倍體關(guān)系,DNA非2倍體出現(xiàn)是鑒別良性與惡性腫瘤的特異性指標(biāo): 良性腫瘤和正常組織良性增生不出現(xiàn)DNA非2倍體細(xì)胞而惡性腫瘤?？沙霈F(xiàn)異倍體細(xì)胞；實(shí)體瘤以多倍體居多；實(shí)體惡性腫瘤的非2倍體出現(xiàn)率>70%,淋巴瘤和白血病以亞二倍體居多,出現(xiàn)率達(dá)50%。交界性腫瘤形態(tài)學(xué)介于良惡性之間,