fcm原理及臨床應用(新)(1)課件

1、流式細胞術(shù)檢測原理及在臨床醫(yī)學中的應用,流式細胞術(shù)(flow cytometry FCM)是利用流式細胞儀對單個生物顆粒(紅細胞、白細胞、各類組織細胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和生物學特性進行多參數(shù)定量分析，并能對特定細胞群體加以分選的分析技術(shù)。,流式細胞術(shù)的概念,FCM的工作原理,流式細胞儀組成：1.液流系統(tǒng)2.光學系統(tǒng)3.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),1.液流系統(tǒng)：由樣本和鞘液組成。待測細胞被制備成單個細胞的懸液，經(jīng)熒光

2、染料標記的McAb染色后置入樣品管中，在清潔氣體壓力下進入流動室形成樣本流。在鞘液 (sheath)的約束下，通過噴嘴，使其形成單細胞液柱。,,,Flow Cell,鞘液：輔助樣本流能被正常檢測的基質(zhì)液作用： 1.包裹在樣本流的周圍，使其處于噴嘴中心，以保證檢測的精確性； 2.防止樣本流中的細胞靠近噴孔壁而堵塞噴孔。,2.光學系統(tǒng)：由激發(fā)光源、分光鏡、光束成形器等組成。激光是較常用的光源, 穩(wěn)定性好、單色性好。

3、檢測信號： 散射光和熒光信號被收集、處理、轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號。,,FCM檢測信號,散射光信號 前向散射光（foword scatter, FS）：在激光束正前方的檢測器，用于檢測細胞或其他粒子物體的表面屬性，如大小、形狀等。反映細胞顆粒的大小。 側(cè)向散射光（side scatter， SS）：與激光束垂直方向的檢測器為側(cè)向檢測器，主要用于檢測細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性，可獲得細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的參數(shù)。反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復雜程

4、度、表面的光滑程度。熒光信號 (反映被染上熒光的細胞數(shù)量多少）,熒光信號,每種熒光染料都有特定的激發(fā)波長，受激光激發(fā)后會產(chǎn)生特定波長的熒光和顏色，如綠色、紅色、黃色等。流式細胞儀就是利用不同波長的光學濾片來檢測這些特定發(fā)射波長的光學信號。熒光信號反映被染上熒光的細胞數(shù)量多少。,3.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：主要由計算機及其軟件組成。 通過檢測散射光及熒光信號對實驗數(shù)據(jù)進行分析存儲、顯示。具有智能化、自動化特點。,免疫熒光標記,直接免疫

5、熒光染色法：選用熒光標記的McAb是直接針對細胞表面抗原特異性標志的單一抗體,如抗CD3-FITC抗體、抗CD4-PE抗體、抗CD8-PeCy5抗體。間接免疫熒光染色法：選用特異性McAb與相應抗原結(jié)合后，再用熒光素標記的第二抗體進行染色。雙標記或多標記分析：目前使用的流式細胞儀能用一個激光束激發(fā)檢測三色甚至四色熒光信號。檢測時需注意熒光補償。,常用免疫熒光染料組合,熒光補償： 每兩種熒光信號間不可避免會出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，重疊區(qū)越大

6、，信號檢測的準確性就越差，因此需計算機工作軟件進行自動跟蹤調(diào)節(jié)補償。,流式細胞儀的基本功能細胞表型分析(包括細胞膜、胞漿內(nèi)蛋白表達及核膜成份分析DNA含量及細胞周期分析：DNA content analysis，如細胞凋亡檢測細胞分選 cell sorting自身免疫性疾病相關(guān)HLA抗原分析、自身抗體的檢測：如用Hep-2細胞檢測抗核抗體。,臨床免疫學 臨床血液學 臨床腫瘤學 血栓與止血 骨髓和器官移植

7、 基礎(chǔ)醫(yī)學研究,流式細胞術(shù)的臨床應用,FCM在臨床免疫學中的應用(1) 淋巴細胞亞群分析 T細胞： CD3+ CD4+ (Th) CD8+ (Ts/Tc) B細胞： CD19+ NK細胞： CD3- CD16+ CD56+,(2) 淋巴細胞亞群細分 T細胞：Ts：CD8+ CD2

8、8- Tc：CD8+ CD28+ Th：CD4+ CD29+ B細胞：B1：CD5+ CD19- B2：CD5 + CD19+,根據(jù)T淋巴細胞分泌細胞因子的不同還可將CD4+、CD8+分為 ? CD4+: Th1: CD4+ IFN-r+

9、 Th2: CD4+ IL4+ Th0: CD4+ IFN-r+ IL4+ ? CD8+: Tc1: CD8+ IFN-r+ Tc2: CD8+ IL4+

10、 Tc0: CD8+ IFN-r+ IL4+,輔助性T細胞亞群的生物學功能及臨床意義Th1細胞：介導細胞免疫、細胞毒性T細胞的生長和活化、巨噬細胞的活化、介導遲發(fā)型過敏反應。其功能亢進將導致炎癥慢性遷延，器官特異性自身免疫病，急性排異反應和接觸性皮炎等的發(fā)病和免疫病理損傷。Th2細胞 ：介導體液免疫，促進B細胞的生長、活化和分化，是IgG1和IgE類抗體的轉(zhuǎn)換因子，其

11、功能亢進將導致特異性過敏反應，參與高IgE綜合癥和嗜酸性粒細胞增多癥。,(3) 活化淋巴細胞亞群 活化總T細胞： CD3+ /HLA—DR+ 靜止總T細胞： CD3+ /HLA—DR- 活化CD4+細胞：CD4+ /HLA—DR+ 活化CD8+細胞：CD8+ /HLA—DR+ 活化誘導分子： CD69 白細胞介素2低親和力受體： CD25 CD25+ /CD3+：活化T細胞 CD25-

12、 /CD3+：靜止T細胞,(4) 淋巴細胞功能分析：細胞介導細胞毒試驗、細胞內(nèi)細胞因子的測定 自身免疫性疾病 變態(tài)反應性疾病 免疫缺陷性疾病 感染性疾病(病毒、細菌、寄生蟲感染) 免疫治療監(jiān)測 腫瘤免疫監(jiān)測 移植免疫監(jiān)測,(二) FCM在臨床血液學中的應用1.白血病的MIC分型 Morphology（形態(tài)學） Immunology（免疫學） Cytogenetics（細胞遺傳學）

13、白血病分型是選擇化療方案和判斷預后的重要依據(jù)。白血病免疫分型是MIC分型的重要組成部分，也是對FAB分型的補充，對白血病的診斷、治療策略制定、預后判斷及對白血病發(fā)病機制的研究都具有重要作用。,免疫分型的臨床意義,? 彌補FAB分型的不足 ? 診斷其他血液系統(tǒng)腫瘤 ? 診斷僅表達個別非本系列相關(guān)抗原的急性 白血?。↙Y+—AML、MY+—ALL） ? 急性雙系或雙表型白血病的診斷 ? 骨髓增生異常綜合征（MDS）

14、免疫表型分析的臨床意義 ? 免疫分型對鑒別慢性淋巴細胞增生性疾病各亞型亦有肯定的診斷價值,以下為各系列較特別的標志： AML： MPO、 CD33、 CDl3、 CDl4 CDl5、 CDllb、 CDllc T-ALL： c／mCD3、 CD2、 CD5、 CD7、 CD4／CD8、 CD38 B-ALL： cCD22、cCD79、 CDl9、 CDl0、 CD24、 HLA—DR、 CD20、

15、 CD38 造血干／祖細胞: CD34、 CDll7、 CD38、 HLA-DR、 ACl33,在AML各亞型的免疫分型中有時仍較難分辨，有以下特點可供參考： ①CD41、CD61是巨核細胞的標志，見于FAB—M7，但 血小板粘附于某細胞上可造成假陽性。 ② CD71與血型糖蛋白是紅系的標志，見于FAB—M6型。 ③ CDl4、 CD64是單核細胞的標志，見于M4或M5。

16、 ④ FAB—M3，t(15；17)者典型的免疫表型是CDl3+、 CD33+、 CD9+、 CD38+、 CD34-、 DR-。 ⑤ t(8；21)M2的表型為 CDl3+、 DR+、 CD34+、 CD33+、 CDl5+、 CDl9+或CD56+。 ⑥ M0與M1較難區(qū)分，應有髓系標志而無淋系標志，胞漿MPO應陰性。 CD34及DR在M0較強，并可伴有CD7與CD4。,⑦ CDll7+多見于AML。 ⑧ CD7常

17、與CD34共表達， CD4見于M4、M5。 CD2+見于M4Eo，往往伴有16號染色體異常。 M3亦可有 CD56+表達。正常粒細跑可表達 CDl0。由此可見，單抗本身有其多向性，勿輕易判斷為雜合型白血病。 ⑨ T／B—ALL可分為幾個亞型，然而對臨床價值不大。但若B—ALL伴有CD34表達時，應進一步作遺傳學與基因檢測，以確定是否是Ph+ALL，不論是M—bcl/abl或m-bcr／ablmRNA陽性者，其預后均較差，應接受大劑

18、量化療或早期接受異基因骨髓移植。,FCM檢測白血病微小殘留病變(MRD): 過去認為 FCM測定殘存白血病細胞不可靠，因為現(xiàn)用的 McAb不能鑒別正常血細胞與白血病細胞。雖然至今尚未發(fā)現(xiàn)白血病細胞特異抗原，但近來有人提出根據(jù)白血病細胞的以下特征， FCM檢測的敏感度可明顯提高,白血病細胞的某些抗原表達量明顯高于相應的正常血細胞 如小兒ALL，其CDl0+細胞的熒光強度可高達3-4個對數(shù)值，而其 CD45則為弱陽性或陰性

19、。相應正常細胞 CDl0+的細胞熒光強度約為2個對數(shù)值， CD45為陽性。若能定量則更可靠。,FCM在臨床腫瘤學中的應用1.血液標本的檢查 腫瘤患者的免疫功能檢查 腫瘤患者的粘附分子檢查ICAM-1 CD54ICAM-2 CD102ICAM-3 CD106CD62、CD63、CD42a/b、CD41/61、TSP,(2) 腫瘤實體標本的FCM檢查 耐藥基因檢查 粘附分子檢查

20、 細胞凋亡檢查 細胞DNA分析 增殖性核抗原 腫瘤細胞耐藥性篩選 腫瘤相關(guān)抗原 激素受體 與癌細胞生物行為有關(guān)的因子，如CD44,組織標本的正確處理： 去除脂肪、結(jié)締組織 洗滌除去紅細胞 用眼科剪剪成肉糜狀 用250至350目的銅網(wǎng)過濾要求： 細胞碎片、細胞連片少，單細胞要多,利用特殊的熒光染料(PI、EB、AO等) 與細胞內(nèi)DNA堿基結(jié)合，被這些熒光染料染色的細胞在激光

21、照射下發(fā)射出熒光，熒光強度與DNA含量成正比。流式細胞儀通過測定細胞的熒光強度推算出細胞的DNA含量。,細胞DNA分析原理,細胞周期與DNA的倍體關(guān)系,DNA非2倍體出現(xiàn)是鑒別良性與惡性腫瘤的特異性指標: 良性腫瘤和正常組織良性增生不出現(xiàn)DNA非2倍體細胞而惡性腫瘤常可出現(xiàn)異倍體細胞；實體瘤以多倍體居多；實體惡性腫瘤的非2倍體出現(xiàn)率>70%,淋巴瘤和白血病以亞二倍體居多,出現(xiàn)率達50%。交界性腫瘤形態(tài)學介于良惡性之間,