包涵體的分離純化

1、包涵體的純化和復(fù)性總結(jié)（二）包涵體的純化和復(fù)性總結(jié)（二）關(guān)于包涵體的純化是一個令人頭疼的問題，包涵體的復(fù)性已經(jīng)成為生物制藥的瓶頸，關(guān)于包涵體的處理一般包括這么幾步：菌體的破碎、包涵體的洗滌、溶解、復(fù)性以及純化，內(nèi)容比較龐雜一、菌體的裂解1、怎樣裂解細菌？細胞的破碎方法1.高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約13體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動開關(guān)后，逐步加速至所需速度。此法適用于動物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子等。2.玻璃

2、勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動物臟器組織。3.超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50100毫克菌體毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理1015分鐘，此法的缺點是在處理過程會產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施，時間以及超聲間歇時間、超聲時間可以自己調(diào)整，

3、超聲完全了菌液應(yīng)該變清亮，如果不放心可以在顯微鏡下觀察。對超聲波及熱敏感的蛋白和核酸應(yīng)慎用。4.反復(fù)凍融法：將細胞在20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結(jié)構(gòu)破碎。5.化學(xué)處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好，我用的濃度一般為1mgml。無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核

4、酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且應(yīng)該在破碎的同時多加幾次；另外，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。這是標準配方:裂解液：50mMTrisHCl(pH8.5~9.0)2mMEDTA100mMN

5、aCl0.5%TritonX1001mgml溶菌酶。(溶菌酶在這個pH范圍內(nèi)比較好發(fā)揮作用)但我個人的經(jīng)驗是:如果你裂解細菌是為了提取蛋白的話而且蛋白的分子量又小于20kd的話盡量減少溶菌酶的用量會引入溶菌酶這種雜蛋白.一般配60ml裂解液用藥匙匙柄盛一點就夠.判斷裂解好壞的標準是溶液很粘.protocol是10ml50ml緩沖液(菌體洗滌液裂解液等)1g濕菌體.如果只做一個鑒定我覺得100200ml菌就夠了.但凡超聲我都用60ml裂解

6、液因為我們的超聲儀(現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)錄象里的那種)很適合用100ml小燒杯裝60ml裂解液這樣能讓超聲頭離液面不高不低不會冒泡泡也不會灑出來.菌多我就延長超聲時間.沉淀也就是包涵體沉淀了如果要上柱純化一定要先用4M尿素洗滌一下再用8M尿素溶解.如果不上柱只是跑跑電泳可以直接用8M尿素溶解以后離心取上清加入適量體積的loadingbuffer.loadingbuffer對于包涵體的溶解能力是較弱的.“取200微升菌液，離心后直接加上

7、樣buffer，100度3分鐘后上樣，然后SDSPAGE.這個方法到底能不能溶解細菌中的包涵體“tmd了。見鬼了。我的操作有什么地方不妥當，請各位指正。溶菌酶的廠商要求是否很重要？我的誘導(dǎo)物來自1：20過夜培養(yǎng)物接種，37C生長3小時后30C誘導(dǎo)2小時（0.8mMIPTG）。是否菌液太濃，Pharmacia的說明書200ml培養(yǎng)物用10ml重懸，我用20ml，仍然不夠?。坑腥烁嬖V我菌液應(yīng)該稀一些，200ml用30－40ml重懸。但實際操

8、作也不夠理想SDSPAGE總是觀察到細胞破碎效果不夠徹底。超聲那么多次，蛋白都要被超碎變性了。3、酵母的破碎酵母是一類單細胞真菌的總稱，其成員分別屬于不同的真菌綱，細胞壁成分是否會有較大差別，這些都是做破碎酵母細胞前要考慮的。我歸納了一下，做破碎酵母的幾種方法：1機械的方法：一般的PROTOCOL都是用glassbeads：如sigmaG8772，加玻璃珠后超聲，蛋白活性保持較好。2化學(xué)裂解的方法：10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分攪拌

9、至液體狀（希望高手點評）3尿素裂解液（尿素8molLNaCl0.5molLTris20mmolLEDTA20mmolL2%SDSPH值8.0）高壓勻漿。（這個好象也該在方法2中）4液氮凍融并研磨酵母破壁，我認為這種可能在小試中比較合適。5溫和的酶法，可能不會會破壞酵母原生質(zhì)體酶法裂解主要用兩種酶：1。蝸牛酶，可以直接從蝸牛的胃液中獲得；2。lyticase，可以從sigma定購。這兩種酶解法都可以和上面的幾種方法結(jié)合使用，尤其是glas

10、sbeads方法，效果很好。我用過化學(xué)裂解的方法，10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分攪拌至液體狀。此法的裂解效果不錯的，不妨試一下。一篇文章是加尿素裂解液（尿素8molLNaCl0.5molLTris20mmolLEDTA20mmolL2%SDSPH值8.0），據(jù)說效果可以酵母破碎效果好的我所做過的方法中還是玻璃珠，就象microbe和rongjunli所說的那樣，效率很高的，而且對目的蛋白活性不會有什么影響。一般應(yīng)該用這個方法。4、超

11、聲破碎的條件選擇超聲破碎的條件不能一概而論，要看你的實驗要求，有的是細菌破碎，有的是對組織細胞進行破碎，要掌握好功率和每次超聲時間，功率大時，每次超聲時間可縮短，不能讓溫度升高，必要時在冰浴條件下進行超聲破碎。至于每次超聲時是否起泡沫到不是關(guān)鍵的問題，這與你超聲的量明顯有關(guān)。5、如何鑒定細菌超聲破碎的程度最簡單的方法：涂片革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色0.5分鐘顯微鏡觀察切記：只用結(jié)晶紫染色，別忘了染色后再用水稍沖洗一下6、細菌裂解的DNaseI

12、不同純度的酶換算標準不同，所以你最好查查是哪個公司的酶？仔細看說明書，可能會有換算說明。另外看一下參考文獻所用的酶是哪個公司的，到該公司的主頁也可能有收獲。我用過華美和TAKARA的DNA酶，華美的是用mgml。華美也有RNasefree的DNA酶，定量用活性單位。TAKARA的兩種酶都是用活性單位定量的。我在超聲裂解細菌時加入一些DNA酶，一般用超聲液加不同量的酶做一個預(yù)實驗，選取符合你需要的酶量。其實根據(jù)目的和方法的不同，所需要的酶