重組腸激酶包涵體的復性、純化及其新型重組子的構建.pdf

1、腸激酶（enterokinase，EK）是一種以異源二聚體形式存在于哺乳動物十二指腸內(nèi)的絲氨酸蛋白酶，可沿胰蛋白酶原序列中（Asp）4-Lys的羧基端切下，從而釋放出活性胰蛋白酶。正是腸激酶在體內(nèi)表現(xiàn)出的這種高度的酶切特異性使其成為當前基因工程領域融合蛋白表達后切割與純化的重要工具之一。較之目前裂解融合蛋白常用的凝血酶、Xa因子等蛋白酶和溴化氰、輕胺等化學試劑，腸激酶具有非特異性切割少，反應條件寬泛，切割位點在全部識別序列之后，切出的目

2、標產(chǎn)品首位氨基酸可完全忠實于天然蛋白等特點。近年來所做的嘗試多是克隆與表達235個氨基酸的具有酶學活性的腸激酶輕鏈（EKL）。 本論文的第一部分是對本實驗室已構建好的工程菌pET39b-EKL/BL21（DE3）的蛋白表達、純化進行研究。先確定了誘導條件：37℃下培養(yǎng)菌體，OD600為0.7時開始誘導，誘導6小時，IPTG終濃度為0.5mmol/L。隨后對培養(yǎng)液上清中的目標蛋白進行親和分離純化，產(chǎn)量為每100毫升原發(fā)酵液中純化后

3、的目標蛋白腸激酶量為43.65μg，純化收率8.34％。由于上清液中腸激酶收率不高，本文又對腸激酶包涵體進行變性復性、純化研究。采用變性上柱、柱上復性方式進行鎳離子親和分離純化，利用產(chǎn)物N段攜帶8個相連的組氨酸與金屬螯合層析介質(zhì)中的鎳離子的親和性，應用Ni-NTA金屬螯和層析對樣品包涵體進行純化分離。實驗結果表明，在變性條件下純化的樣品在柱上不經(jīng)洗脫，直接用復性液洗滌，可以使腸激酶在得到提純的同時實現(xiàn)復性。最后優(yōu)化復性條件，提高收率。經(jīng)

4、測定包涵體復性后產(chǎn)量可達到470μg，純化收率可達到20.3％。 第二部分，本論文開創(chuàng)了另一種利用腸激酶蛋白的新思路--構建雙質(zhì)粒系統(tǒng)，讓目的融合蛋白在體系中不需要再單獨加入腸激酶蛋白就可進行融合蛋白的切割。并針對現(xiàn)在工業(yè)化生產(chǎn)中融合蛋白有以包涵體形式和可溶分泌表達形式兩種情況，對雙質(zhì)粒系統(tǒng)進行了初步的構建。構建了一個復制子與大多商業(yè)化質(zhì)粒不相同，拷貝數(shù)低，不影響目的蛋白大量表達的重組子-pSB3K3-EKL。將EKL基因插入到