水稻亞細(xì)胞定位標(biāo)記系穩(wěn)定遺傳株系培育及其應(yīng)用初探.pdf

1、亞細(xì)胞定位，是指某種蛋白質(zhì)或者表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的具體存在部位。蛋白質(zhì)的功能與其所在的亞細(xì)胞位置密切相關(guān)，而亞細(xì)胞定位研究可以為確定某些未知蛋白質(zhì)的功能提供重要的參考信息。在前期研究中，本課題組已經(jīng)構(gòu)建了一套保守性定位于主要細(xì)胞器的、且攜帶有特異性熒光蛋白GFP/RFP融合結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)載體，并初步獲得了轉(zhuǎn)基因水稻材料，其中包含的亞細(xì)胞定位類型主要有：細(xì)胞膜、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)體、線粒體、高爾基體、液泡、過氧化物酶體及細(xì)胞骨架。
　

2、　本研究主要內(nèi)容包括：⑴經(jīng)過潮酶素抗性篩選、PCR驗(yàn)證、原生質(zhì)體熒光觀察及水稻葉鞘組織熒光觀察，驗(yàn)證了絕大多數(shù)前期所培育的標(biāo)記系材料能夠穩(wěn)定表達(dá)熒光信號，并且正確定位于預(yù)測的細(xì)胞器；⑵針對轉(zhuǎn)化pCXSN-RFPAtCCASP、pCXSN-GFPmTn、pCXSN-RFPH2B、pCXSN-RFP等結(jié)構(gòu)的熒光信號弱或未檢測到熒光信號的材料，重新構(gòu)建了以Ubiquitin強(qiáng)啟動子替代35S啟動子驅(qū)動熒光蛋白融合結(jié)構(gòu)表達(dá)的載體，并進(jìn)行了驗(yàn)證；

3、⑶以穩(wěn)定表達(dá)核定位綠色熒光標(biāo)記GFP-H2B的水稻為例子，將一個水稻轉(zhuǎn)錄因子WRKY45-RFP融合表達(dá)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化到GFP-H2B水稻原生質(zhì)體中，熒光觀察結(jié)果顯示W(wǎng)RKY45-RFP和GFP-H2B共定位于細(xì)胞核中，表明本研究所培育的熒光標(biāo)記系能夠應(yīng)用于水稻蛋白的亞細(xì)胞共定位研究；⑷同樣以GFP-H2B水稻為材料，以表達(dá)PWL2-mCherry-NLS的稻瘟菌株pBV591侵染GFP-H2B水稻葉鞘組織，熒光觀察結(jié)果顯示， PWL2-mC