epo調(diào)節(jié)人cd3439;造血干細(xì)胞cd26的表達(dá)及cd26單克隆抗體的制備和鑒定

1、第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文EPO調(diào)節(jié)人CD34造血干細(xì)胞CD26的表達(dá)及CD26單克隆抗體的制備和鑒定姓名：范婭涵申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)教師：趙樹銘20090501第三軍醫(yī)人學(xué)碩士學(xué)位論文響；第二部分，構(gòu)建C D 2 6 原核表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)C D 2 6 融合蛋白作為抗原制備C D 2 6酶催化結(jié)構(gòu)域單克隆抗體。方法1 ．從臍血中分離單個(gè)核細(xì)胞( M N C ) ，按M A C S —C D 3 4 + 免疫磁珠分選

2、試劑盒說明書操作分選C D 3 4 + 細(xì)胞。應(yīng)用流式細(xì)胞儀法檢測(cè)經(jīng)M A C S ．C D 3 4 + 免疫磁珠分選并采用E P 0 處理后培養(yǎng)的人c D 3 4 + 臍血干細(xì)胞，通過與酶底物反應(yīng)檢測(cè)人c D 3 4 + 臍血造血干細(xì)胞表面C D 2 6 的表達(dá)情況。2 ．構(gòu)建原核表達(dá)載體，并誘導(dǎo)表達(dá)C D 2 6 融合蛋白。應(yīng)用R 1 1 - P c R 技術(shù)以人白細(xì)胞m R N A 為模板，擴(kuò)增獲取編碼C D 2 6 催化結(jié)構(gòu)域的

3、基因序列，克隆入原核表達(dá)載體P E T 3 2 a 后，轉(zhuǎn)化硯2 J 感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)P T G 誘導(dǎo)表達(dá)得到h i s ．C D 2 6 融合蛋白。親和層析柱純化并經(jīng)W 色s t e m B l o t 鑒定。3 ．制備針對(duì)C D 2 6 酶功能區(qū)域的單克隆抗體。用h i s ．C D 2 6 融合蛋白作為抗原足摯快速法免疫B A L B ／C 小鼠，采用雜交瘤技術(shù)，制備抗C D 2 6 單克隆抗體。用E L I S A 方法篩選分泌抗

4、C D 2 6 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，采用w e s t e mB l o t 和免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法進(jìn)行特異性鑒定。同時(shí)采用E u S A 方法鑒定M c A b 的I g 亞類，檢測(cè)M c A b 的效價(jià)并進(jìn)行M c A b 結(jié)合表位分析。并對(duì)其染色體進(jìn)行分析。結(jié)果1 ．檢測(cè)E P O 處理1 8 h 前后臍血干細(xì)胞：未加細(xì)胞因子組和加入不同濃度細(xì)胞因子組的C D 3 4 + 細(xì)胞比例沒有顯著變化；而與對(duì)照組相比，經(jīng)E P Ol

5、 o o U ／1 1 1 l 和E P 0 2 0 0 U ／1 1 1 l1 8 h 培養(yǎng)后的C D 3 4 + 臍血造血干細(xì)胞群中C D 2 6 + 細(xì)胞比例明顯上升，C D 2 6 + 細(xì)胞在c D 3 4 + 細(xì)胞群中的比例隨著E P O 濃度呈上升趨勢(shì)。c D 3 4 + 細(xì)胞上C D 2 6 酶活性隨E P O 濃度升高，其活性在1 0 0 u 后呈明顯升高( P < O ．0 5 ) 。2 ．采用P C R 方法擴(kuò)

6、增得到與預(yù)期大小一致的目的基因片段約為6 6 0 b p 。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定及測(cè)序分析證實(shí)重組質(zhì)?？寺〕晒?。轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌后成功誘導(dǎo)出分子量為4 l K D a 的融合蛋白，與預(yù)測(cè)的蛋白分子質(zhì)量一致。超聲破菌后，鑒別誘導(dǎo)蛋白以包涵體形式表達(dá)。大量誘導(dǎo)表達(dá)后，溶解包涵體，經(jīng)過N i 2 + 螯合親和層析，純化后幾乎無大于目的片段的雜蛋白，達(dá)到動(dòng)物免疫純度要求。純化蛋白W e s t e mB l o t 鑒定：結(jié)果顯示純化后的融合蛋白