人CD244基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建及其單克隆抗體的研制.pdf

1、第一部分、人CD244基因克隆及其基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立
　　 目的：構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人CD244基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
　　 方法：通過(guò)RT-PCR獲得人CD244全長(zhǎng)cDNA，而后進(jìn)行PCR擴(kuò)增;將人CD244全長(zhǎng)cDNA重組入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pEGZ-Term。經(jīng)測(cè)序正確后，通過(guò)脂質(zhì)體法將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term/CD244和輔助病毒載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T;收集含有完整重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的293T細(xì)胞培養(yǎng)上清

2、，用以感染L929細(xì)胞和BaF細(xì)胞;采用Zeocin篩選，獲得Zeocin抗性的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Zeocin抗性的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞GFP和CD244的表達(dá)。
　　 結(jié)果：成功克隆人CD244全長(zhǎng)cDNA，并成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人CD244的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/CD244和BaF/CD244。
　　 結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)人CD244的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，為研制鼠抗人CD244單克隆抗體和研究CD244生

3、物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分、鼠抗人CD244單克隆抗體的研制
　　 目的：研制鼠抗人CD244單克隆抗體。
　　 方法：以穩(wěn)定表達(dá)人CD244的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/CD244為免疫原，免疫6～8周齡的BALB/c小鼠;采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，將免疫小鼠的脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，并于HAT選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng);以L929/CD244作為陽(yáng)性篩選細(xì)胞株，并以轉(zhuǎn)染pEGZ-Term空載

4、體的L929/mock細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term/CD48的L929/CD48細(xì)胞株作為陰性對(duì)照，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選;對(duì)所得陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行多次克隆化培養(yǎng)，直至獲得持續(xù)穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CD244單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株;采用快速定性試紙法鑒定單抗亞型;采用間接免疫熒光法檢測(cè)單抗特異性，并分析所獲單抗對(duì)健康人PBMC中T細(xì)胞和不同來(lái)源的腫瘤細(xì)胞表面CD244分子的識(shí)別。
　　 結(jié)果：獲得