人CD83轉(zhuǎn)基因細胞的構(gòu)建及鼠抗人CD83單克隆抗體的研制.pdf

1、CD83是表達于成熟樹突狀細胞(DC)和活化的B、T淋巴細胞的重要功能分子，對T細胞在胸腺中的發(fā)育起著重要的作用。未成熟DC表面雖然缺少CD83的表達，但在其細胞內(nèi)可檢測到CD83蛋白。膜型CD83(membraneCD83，mCD83)蛋白可以水解形成可溶性CD83(solubleCD83，sCD83)，存在于正常人血清中。sCD83能夠影響DC的成熟，以及DC介導的T細胞增殖，具有免疫抑制活性。sCD83能夠顯著抑制實驗性自身免疫病

2、病變的發(fā)生，而且還能有效地抑制移植排斥反應。有研究認為與CD83相互作用的分子存在于單核和CD8+T細胞亞群。最近，一些研究發(fā)現(xiàn)了一些特殊的CD83+細胞，單核細胞在IFN-α作用下誘導成CD83+CDl4+細胞群，該細胞群不具有典型DC的表型，卻具有相似的吞噬功能，而單核細胞在GM-CSF作用下誘導成CDl4low CD83+DCSIGN-細胞群，因此CD83的生物學特性及其信號傳導途徑尚待進一步研究。 也已表明許多免疫分子的

3、特異性抗體，可模擬或阻斷該分子的信號。該類抗體可為深入研究免疫分子的生物學效應及分子機制提供重要的手段。同時通過特異抗體增強或減弱協(xié)同信號轉(zhuǎn)導，對免疫功能低下或異常升高的疾病具有干預作用。因此，CD83分子轉(zhuǎn)基因細胞的構(gòu)建及功能性單克隆抗體的研制在基礎研究及臨床應用中具有重要價值。本論文共分為兩個部分。 1.人CD83轉(zhuǎn)基因細胞株的構(gòu)建 用TRIZOI從成熟的DC中提取總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以特異性引物進行擴增，

4、然后進行雙酶切裝入pIRES2-EGFP載體，進行測序，測序正確后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染L929細胞，篩選穩(wěn)定表達株。pIRES2-EGFP載體中既有G418抗性標記基因，又有綠色熒光蛋白GFP報告基因，對于轉(zhuǎn)基因細胞具有雙重的篩選作用，大大提高了所篩細胞的陽性率。通過流式細胞儀反復篩選，獲得一株穩(wěn)定表達CD83的轉(zhuǎn)基因細胞株，通過RT-PCR能夠檢測到目的基因的表達。 2.一株鼠抗人CD83單克隆抗體的研制及其特性鑒定 以高表達

5、膜型CD83分子的轉(zhuǎn)基因細胞株L929/CD83為免疫原，采用B淋巴細胞融合技術(shù)，將免疫小鼠脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行融合。以人CD83基因轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細胞株L929/CD83及293/CD83為陽性篩選細胞，經(jīng)反復篩選及克隆化培養(yǎng)，獲得一株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CD83單抗的雜交瘤細胞株，命名為9D8?？焖俣ㄐ栽嚰埛ǚ治觯?D8重鏈為IgGl，輕鏈為K鏈。經(jīng)體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，液氮凍存，復蘇后生長良好，抗體分泌性能穩(wěn)定。染色

6、體數(shù)目分析顯示，雜交瘤細胞株的染色體在100條以上。采用本室建立的腹水誘生法制備單抗，腹水形成陽性率約為80％以上，腹水的收獲量平均為5 mL/只。經(jīng)Protein G親和層析柱分離純化，腹水中抗體蛋白的得率為1.5～2.0 mg/L。純化抗體用于間接免疫熒光檢測的用量為0.2-1μ g/1×106細胞。經(jīng)Western blot分析，9D8能與CD83分子特異性結(jié)合，表明9D8是CD83的特異性單抗。該單抗能識別人B淋巴瘤細胞株Dau