人CD83轉(zhuǎn)基因細胞的構(gòu)建及鼠抗人CD83單克隆抗體的研制.pdf

1、CD83是表達于成熟樹突狀細胞(DC)和活化的B、T淋巴細胞的重要功能分子，對T細胞在胸腺中的發(fā)育起著重要的作用。未成熟DC表面雖然缺少CD83的表達，但在其細胞內(nèi)可檢測到CD83蛋白。膜型CD83(membraneCD83，mCD83)蛋白可以水解形成可溶性CD83(solubleCD83，sCD83)，存在于正常人血清中。sCD83能夠影響DC的成熟，以及DC介導(dǎo)的T細胞增殖，具有免疫抑制活性。sCD83能夠顯著抑制實驗性自身免疫病

2、病變的發(fā)生，而且還能有效地抑制移植排斥反應(yīng)。有研究認為與CD83相互作用的分子存在于單核和CD8+T細胞亞群。最近，一些研究發(fā)現(xiàn)了一些特殊的CD83+細胞，單核細胞在IFN-α作用下誘導(dǎo)成CD83+CDl4+細胞群，該細胞群不具有典型DC的表型，卻具有相似的吞噬功能，而單核細胞在GM-CSF作用下誘導(dǎo)成CDl4low CD83+DCSIGN-細胞群，因此CD83的生物學(xué)特性及其信號傳導(dǎo)途徑尚待進一步研究。 也已表明許多免疫分子的

3、特異性抗體，可模擬或阻斷該分子的信號。該類抗體可為深入研究免疫分子的生物學(xué)效應(yīng)及分子機制提供重要的手段。同時通過特異抗體增強或減弱協(xié)同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對免疫功能低下或異常升高的疾病具有干預(yù)作用。因此，CD83分子轉(zhuǎn)基因細胞的構(gòu)建及功能性單克隆抗體的研制在基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用中具有重要價值。本論文共分為兩個部分。 1.人CD83轉(zhuǎn)基因細胞株的構(gòu)建 用TRIZOI從成熟的DC中提取總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以特異性引物進行擴增，

4、然后進行雙酶切裝入pIRES2-EGFP載體，進行測序，測序正確后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染L929細胞，篩選穩(wěn)定表達株。pIRES2-EGFP載體中既有G418抗性標記基因，又有綠色熒光蛋白GFP報告基因，對于轉(zhuǎn)基因細胞具有雙重的篩選作用，大大提高了所篩細胞的陽性率。通過流式細胞儀反復(fù)篩選，獲得一株穩(wěn)定表達CD83的轉(zhuǎn)基因細胞株，通過RT-PCR能夠檢測到目的基因的表達。 2.一株鼠抗人CD83單克隆抗體的研制及其特性鑒定 以高表達

5、膜型CD83分子的轉(zhuǎn)基因細胞株L929/CD83為免疫原，采用B淋巴細胞融合技術(shù)，將免疫小鼠脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行融合。以人CD83基因轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細胞株L929/CD83及293/CD83為陽性篩選細胞，經(jīng)反復(fù)篩選及克隆化培養(yǎng)，獲得一株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CD83單抗的雜交瘤細胞株，命名為9D8。快速定性試紙法分析，9D8重鏈為IgGl，輕鏈為K鏈。經(jīng)體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，液氮凍存，復(fù)蘇后生長良好，抗體分泌性能穩(wěn)定。染色

6、體數(shù)目分析顯示，雜交瘤細胞株的染色體在100條以上。采用本室建立的腹水誘生法制備單抗，腹水形成陽性率約為80％以上，腹水的收獲量平均為5 mL/只。經(jīng)Protein G親和層析柱分離純化，腹水中抗體蛋白的得率為1.5～2.0 mg/L。純化抗體用于間接免疫熒光檢測的用量為0.2-1μ g/1×106細胞。經(jīng)Western blot分析，9D8能與CD83分子特異性結(jié)合，表明9D8是CD83的特異性單抗。該單抗能識別人B淋巴瘤細胞株Dau