抗CD133人源性單克隆抗體的篩選、鑒定及表達.pdf

1、CD133蛋白(prominin-1)屬于五次跨膜蛋白—prominin家族，是該家族首個被鑒定的成員。Prominin家族蛋白的功能及其相應(yīng)配體至今尚不清楚。目前已有大量研究表明CD133是多種人體腫瘤干細胞表面標志分子之一。CD133分子已經(jīng)在人類多種惡性腫瘤中用于分離和富集細胞亞群，該細胞群體能在體外形成克隆，并能在動物體內(nèi)形成腫瘤。最近研究表明CD133分子是有價值的細胞表面標志分子，有希望成為新治療策略中的靶標。目前已有針對C

2、D133分子的鼠源性單克隆抗體，但由于其鼠源性會產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)，并且完整單抗分子過大難以進入腫瘤組織內(nèi)，使其體內(nèi)診斷及治療受到了限制。因此，制備高特異性抗CD133的人源性單克隆抗體有重要意義。
　　 本研究通過原核表達并純化CD133分子第二胞外片段(loop1)和第三胞外片段(loop2)蛋白。純化后的CD133-loop1-HIS和CD133-loop2-HIS蛋白經(jīng)間接ELISA檢測顯示與鼠源抗CD133抗體

3、發(fā)生特異性結(jié)合。以純化后的CD133-loop1-HIS和CD133-loop2-HIS蛋白作為靶分子，篩選Tomlinson I+J文庫，獲得人源性scFv噬菌體抗體。在篩選抗體庫過程中，噬菌體種類、固相介質(zhì)表面抗原密度或溶液中抗原濃度和清洗時間三個因素對篩選效率影響最大。因本次使用的scFv抗體庫為無偏性的天然文庫，所以采用了五輪篩選，前兩輪采用中等的嚴密度，避免高親和力但低表達的噬菌體抗體克隆丟失。后三輪的嚴格篩選達到了篩選目的。

4、第五輪噬菌體的投入產(chǎn)出率比第三輪增加了42.5倍。將五輪篩選獲得的多克隆噬菌體抗體均進行ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)五輪篩選的OD450nm吸光度值逐漸升高。以第五輪篩選后獲得的多克隆噬菌體抗體感染宿主菌XL1-blue，挑取其中的單個菌落，制備出101株單克隆噬菌體抗體，用ELISA測定其抗原結(jié)合活性，以P/N值＞2.1為陽性克隆，共計挑選87個陽性克隆，陽性率為86.1％。挑取其中6個P/N值＞8的陽性克隆做進一步研究。
　　 以挑

5、取的6株單克隆噬菌體抗體感染大腸桿菌XL1-Blue，擴增后提取噬菌粒，構(gòu)建可溶性scFv表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)1mM IPTG誘導(dǎo)后收集菌體周質(zhì)和包涵體蛋白。ELISA檢測證實有1個克隆成功地表達了可溶性的scFv抗體蛋白，可溶性抗體與人CD133蛋白有特異結(jié)合活性。純化后的scFv-1能夠與鼠源CD133單抗發(fā)生相互競爭及抑制作用，說明其識別并結(jié)合的抗原表位一致或有一定程度的相互重疊。通過對克隆1的可變區(qū)進行序

6、列測定分析與NCBI-BLAST檢索，證實其與人免疫球蛋白IgG重鏈VH3氨基酸同源性為93％，差異主要集中在CDR2、CDR3區(qū)，輕鏈V區(qū)與人免疫球蛋白Vκ1氨基酸同源性為97％， CDR1、CDR2、CDR3區(qū)均存在氨基酸差異。根據(jù)同一家族中核苷酸序列同源性大于80％，說明所獲抗體基因重鏈屬于人抗體VH3家族，輕鏈屬于人抗體Vκ家族。
　　 本研究以噬菌體展示技術(shù)得到了人源性抗CD133的單克隆抗體并初步探索了該抗體的部分生