ⅰ.小金海棠mxirt1的離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞定位與降解途徑研究;ⅱ.水稻osnat7的底物轉(zhuǎn)運(yùn)功能研究

1、首都師范大學(xué)博士學(xué)位論文Ⅰ.小金海棠MxIRT1的離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞定位與降解途徑研究;Ⅱ.水稻OsNAT7的底物轉(zhuǎn)運(yùn)功能研究姓名：李鵬申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：植物學(xué)指導(dǎo)教師：印莉萍20080520但對(duì)C d 的轉(zhuǎn)運(yùn)作川并不必要。這一結(jié)果與C o n n o l l y 實(shí)驗(yàn)室點(diǎn)突變的結(jié)果不一致，推測(cè)這一基序的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)?。瓼 e 的轉(zhuǎn)運(yùn)彳丁作J } J 。3 ．分泌途徑對(duì)于M x l R T l 蛋白的正確定位十分必要為證實(shí)M x I R

2、 T l 在質(zhì)膜上發(fā)揮離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，利用M x l R T l ：：G F P 融合蛋白在酵母細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)其定位于質(zhì)膜和胞內(nèi)的膜( 囊) 泡內(nèi)。缺鐵條件下( 加入鐵螯合劑) 培養(yǎng)的酵母細(xì)胞內(nèi)，點(diǎn)狀綠色熒光增多，暗示膜泡包裹的M x l R T l 通過(guò)分泌途徑完成質(zhì)膜的定位過(guò)程。同時(shí)發(fā)現(xiàn)刪切信號(hào)肽的M x l R T l 不能發(fā)揮F e 、C d 的轉(zhuǎn)運(yùn)功能證實(shí)了信號(hào)肽在分泌過(guò)程中的作用，也說(shuō)明分泌途徑在蛋白定位中的重要性。4 ．不同

3、鐵離子濃度影響M x l R T l ：：G F P 蛋白定位及蛋白豐度通過(guò)對(duì)不同鐵濃度下M x l R T l ：：G F P 的定何觀察，發(fā)現(xiàn)缺鐵條件。卜．融合蛋白分布在酵母細(xì)胞內(nèi)的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，而正常鐵條件‘卜．綠色熒光可集中在質(zhì)膜的部分區(qū)域。隨著培養(yǎng)基中鐵濃度的增高和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度減弱，暗示了M x l R T l 蛋白的降解過(guò)程。為進(jìn)一步探究這一過(guò)程，應(yīng)用帶有誘導(dǎo)型啟動(dòng)予的表達(dá)載體對(duì)鐵影響M x l R T l

4、細(xì)胞定位及蛋白豐度開(kāi)展了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：過(guò)量誘導(dǎo)表達(dá)M x I R T I ：：G F P 融合蛋白的酵母細(xì)胞中，在液泡中會(huì)出現(xiàn)綠色熒光，熒光強(qiáng)度隨鐵濃度的增加而增強(qiáng)。暗示了M x I R T l 的降解是依賴丁液泡的降解途徑，外源鐵濃度的增加會(huì)加速這一過(guò)程。通過(guò)蛋白印跡的實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)鼙鐵條件下( > 1m M F e 2 + ) 培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中，M x l R T I ：：G F P 的蛋白豐皮下降，而缺鐵條件下的蛋白車度和朱

5、處理細(xì)胞之間無(wú)明顯差異。通過(guò)M x l R T l ：：G F P 在內(nèi)吞突變體( e n d 4 ) 酵母細(xì)胞中的定位研究發(fā)現(xiàn)，綠色熒光仍然可以定位在液泡內(nèi)，表明降解途徑不依賴或不完全依賴E N D 4 基岡介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑，發(fā)生降解的蛋白可能米源于新合成的蛋白。而在蛋白酶A 突變體( p e p 4 ) 細(xì)胞中，綠色熒光入量在液泡中積累，暗示了降解過(guò)程對(duì)P E P 4 基因的依賴。5 ．M x l R T l 蛋白在植物細(xì)胞定位丁質(zhì)膜

6、和胞內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)為了解M x l R T l 在植物細(xì)胞中的定位，分別川瞬時(shí)表達(dá)載體和穩(wěn)定表達(dá)載體對(duì)B Y - 2 原生質(zhì)體和懸浮細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)的M x l R T ：：G F P 融合蛋白定位于質(zhì)膜和胞內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)上。加鐵和缺鐵處理其細(xì)胞定位和熒光強(qiáng)度未發(fā)生變化，暗示植物細(xì)胞與酵母細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制存在不同，可能需要整個(gè)植株或某些器官對(duì)鐵濃度的反應(yīng)。6 ．轉(zhuǎn)基岡水稻植株中正、反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的株系T 1 代種子朱表現(xiàn)金