ARDS狀態(tài)下肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞鈉轉(zhuǎn)運(yùn)功能的研究.pdf

1、研究背景與目的 傳統(tǒng)的理論認(rèn)為：肺水腫的發(fā)病機(jī)制主要是由于液體靜水壓過高(心源性肺水腫)和肺泡毛細(xì)血管通透性增加(非心源性)所致。但是，自Goodman首次發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞存在鈉主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式后，接下來大量的研究均表明，肺水腫的形成除靜水壓力和上皮通透性的影響外，還受上皮細(xì)胞液體清除功能的影響，而這種清除功能是以鈉水的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)形式來實(shí)現(xiàn)的。即肺水腫的機(jī)制中可能存在“二個(gè)增水、一個(gè)減水”的機(jī)制，這一種肺泡液體平衡調(diào)節(jié)減水機(jī)制的發(fā)現(xiàn)和

2、證實(shí)，將帶來肺水腫發(fā)生機(jī)理觀念的重大改變。我們前期的工作也證明存在肺水腫發(fā)生的“第三機(jī)制”，該機(jī)制的干預(yù)也可能將帶來治療上的重大突破。 肺泡上皮細(xì)胞覆蓋95％的肺泡面積，由扁平的Ⅰ型細(xì)胞和立方狀的Ⅱ型細(xì)胞組成。Ⅱ型細(xì)胞數(shù)量較Ⅰ型細(xì)胞多，除分泌表面活性物質(zhì)外，還存在水通道(aquaporin，AQP)、鈉通道、Na+，K+-ATP酶，提示肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞在肺泡液體平衡調(diào)節(jié)中起著重要的作用，奠定了Ⅱ型細(xì)胞在鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)中的地位，所以對(duì)肺

3、泡Ⅱ型上皮細(xì)胞鈉通道功能的研究，有著十分重要的意義和價(jià)值。由于目前還不能分離和培養(yǎng)Ⅰ型細(xì)胞，且數(shù)量上也較少，無證據(jù)表明其參與鈉水的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。 鈉通道、Na+-K+-ATP酶是細(xì)胞膜主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)鈉離子的專用通道，隨著鈉離子的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)而帶動(dòng)水的轉(zhuǎn)移。那么，既然肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞存在鈉、水通道，存在主動(dòng)液體轉(zhuǎn)運(yùn)的“減水“機(jī)制，為什么還會(huì)發(fā)生肺水腫呢?如何來解釋這種現(xiàn)象呢?此外，肺泡上皮細(xì)胞鈉主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能的調(diào)節(jié)機(jī)制以及病理狀態(tài)如ARDS時(shí)上皮

4、細(xì)胞的液體吸收功能和調(diào)節(jié)機(jī)制目前也沒有定論。而鈉通道激動(dòng)劑在減少或阻斷ARDS肺水腫的形成方面的作用，也需要進(jìn)一步深入研究。 因此，我們通過大量的基礎(chǔ)工作，在預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得一定結(jié)果的基礎(chǔ)上，擬通過應(yīng)用膜片鉗技術(shù)的全細(xì)胞電位固定模式，觀察急性分離后5h內(nèi)的正常和油酸ARDS模型中大鼠肺泡Ⅱ型細(xì)胞全細(xì)胞鈉電流的大小及其對(duì)鈉轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑、激動(dòng)劑的反應(yīng)，為ARDS發(fā)病機(jī)制的研究提供新的實(shí)驗(yàn)方向和依據(jù)，從而進(jìn)一步完善對(duì)ARDS肺水腫發(fā)生機(jī)理的認(rèn)

5、識(shí)。 研究方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用壯年健康雄性Sprague-Dawley大鼠(由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所提供)，體重180-235g。本實(shí)驗(yàn)分為2部分，第一部分主要是通過觀察急性分離后5小時(shí)內(nèi)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的全細(xì)胞鈉電流，以明確是否能用急性分離的細(xì)胞來研究細(xì)胞鈉主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)；第二部分實(shí)驗(yàn)分為油酸組和正常生理鹽水對(duì)照組，主要是觀察正常和ARDS狀態(tài)下肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的鈉電流及其對(duì)鈉通道激動(dòng)劑的反應(yīng)，這部

6、分是本實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)和關(guān)鍵.具體方法如下所述： 大鼠ATⅡ的分離、純化和鑒定：采用改良的胰酶消化法分離肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞后，用大鼠IgG包被的培養(yǎng)皿純化，并用0.4％臺(tái)盼蘭溶液鑒定細(xì)胞活力，用改良的鞣酸染色法以及透射電鏡鑒定細(xì)胞純度，并在透射電鏡下觀察肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。 大鼠油酸ARDS模型的建立：油酸是一種具有較強(qiáng)毒性的飽和脂肪酸，進(jìn)入機(jī)體后會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生很復(fù)雜的影響，特別是對(duì)肺組織影響較大，可誘發(fā)并擴(kuò)大氧化性肺損傷

7、。油酸模型是目前公認(rèn)比較好的ARDS模型。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)尾靜脈注射油酸法建立大鼠ARDS模型，油酸用量為0.1ml/kg。 膜片鉗實(shí)驗(yàn)：本實(shí)驗(yàn)采用膜片鉗技術(shù)中的全細(xì)胞電位固定記錄模式測定電流強(qiáng)度。細(xì)胞封接并形成全細(xì)胞狀態(tài)后，立即調(diào)節(jié)相關(guān)旋紐補(bǔ)償串連電阻、補(bǔ)正電容性電流使其盡可能地變小，濾波頻率為1kHz。在實(shí)驗(yàn)的第一部分，應(yīng)用階梯式脈沖來測定跨膜電流的膜電位依賴性，在-40mv的鉗制電位下，給予細(xì)胞膜的電刺激從-100mv起以20

8、mv的步幅遞增到+100mv，激活形成一系列跨膜電流；實(shí)驗(yàn)的第二部分，鉗制電位仍舊為-40mv，每5秒給予細(xì)胞膜-100mv的電刺激，共記錄5次。獲得的所有電流信號(hào)通過Clampex和Fetchen采樣程序采入計(jì)算機(jī)，采樣頻率設(shè)為5kHz。采集到的數(shù)據(jù)用Clampfit6.0軟件和Fetchan進(jìn)行分析.研究結(jié)果 1.我們改良后的大鼠ATⅡ細(xì)胞的分離純化方法是可行的。經(jīng)臺(tái)盼蘭染色測定細(xì)胞活力正常組89.6±2.6％，油酸組85.

9、1±4.6％。經(jīng)鞣酸特殊染色后鑒定ATⅡ細(xì)胞純度，正常組純化前細(xì)胞純度為74.9±3.8％，純化后明顯上升至88.4±3.3％，油酸組純化后純度82.7±3.7％。 2.急性分離的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞具有鈉主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能。在全細(xì)胞的電位固定記錄模式下，我們成功地記錄到急性分離后5小時(shí)內(nèi)的大鼠ATⅡ細(xì)胞的跨膜電流。當(dāng)應(yīng)用SES為浴液時(shí)，該電流的翻轉(zhuǎn)電位在0mv左右；而當(dāng)浴液中含有10μM阿米洛利時(shí)，該細(xì)胞的跨膜電流明顯減小，且翻轉(zhuǎn)電位明

10、顯改變，約為-40mv。由此可見該跨膜電流是以阿米洛利敏感性鈉電流為主，其翻轉(zhuǎn)電位約為+50mv。 3.大鼠油酸ARDS模型的成功建立以及病理狀態(tài)下ATⅡ細(xì)胞的成功分離是實(shí)驗(yàn)第二部分的前提和基礎(chǔ)。經(jīng)大鼠尾靜脈注射油酸制備ARDS急性動(dòng)物模型成功率高，注入油酸后30s大鼠即出現(xiàn)明顯的癥狀如呼吸急促、顏面四肢皮膚發(fā)紺等，血?dú)夥治鲲@示PH、PaO2明顯下降，PaCO2明顯上升；雙肺明顯充血、出血以及大片水腫，肺組織HE染色觀察可見肺泡

11、和肺間質(zhì)水腫、出血；毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，粒細(xì)胞浸潤；肺泡腔大量血性液體滲出，部分可見局灶性肺不張。油酸ARDS大鼠ATⅡ細(xì)胞的分離難度明顯增加，分離后活力85.1±4.6％，純度82.7±3.7％,均明顯低于正常組。電鏡下見細(xì)胞變性、凋亡甚至崩解，板層體排空出現(xiàn)空泡樣改變，微絨毛消失。 4.給予細(xì)胞-100mv刺激時(shí)正常組全細(xì)胞鈉電流-101.11±11.41PA，而油酸組為-65.17±11.48PA，較對(duì)照組明顯下降(p＜0

12、.01)，但二者均能被阿米絡(luò)利顯著抑制；油酸組對(duì)特布他林的敏感性較對(duì)照組有所增高，應(yīng)用特布他林后全細(xì)胞鈉電流可上升一倍以上，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析二者之間存在顯著差異(p＜0.01)。 結(jié)論 1.采用改良的胰酶消化法可以成功分離正常和油酸ARDS大鼠的ATⅡ細(xì)胞，用大鼠IgG包被培養(yǎng)皿純化細(xì)胞、鞣酸染色法鑒定細(xì)胞純度簡單可行，而透射電鏡是鑒定細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)。 2.急性分離的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞具有鈉主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能，其全細(xì)胞鈉電流能

13、夠被阿米洛利明顯抑制，而特布他林則可使該電流明顯增大，提示鈉通道抑制劑和激動(dòng)劑均能對(duì)其產(chǎn)生影響。觀察急性分離的ATⅡ細(xì)胞鈉電流是本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)之一。 3.經(jīng)尾靜脈注射油酸建立大鼠ARDS急性模型是一個(gè)相對(duì)簡單而成功率高的方法，大鼠血PaO2明顯下降，PaCO2明顯上升，肺部出現(xiàn)明顯病理改變，上皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)明顯變化。 4.ARDS狀態(tài)下，ATⅡ細(xì)胞受損明顯，但其仍舊具有一定的鈉轉(zhuǎn)運(yùn)功能，且對(duì)鈉通道激動(dòng)劑的敏感性較