結核分枝桿菌wbbl蛋白質在e.coli中的可溶性表達和鑒定

1、大連醫(yī)科大學碩士學位論文結核分枝桿菌WbbL蛋白質在E.coli中的可溶性表達和鑒定姓名：鄔強申請學位級別：碩士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：馬郁芳20050601障。結核分枝桿菌H 3 7 R v 菌株的基因組測序工作已完成。因此，H 3 7 R v 基因組數據庫為快速克隆目的基因提供了保障。編碼結核分枝桿菌鼠李糖基轉移酶的w b b L 基因為基因組中的第3 2 6 5個開放閱讀框R v 3 2 6 5 。本論文的目的是：(

2、1 ) 利用P C R 方法從結核分枝桿菌H 3 7 R v 菌株的基因組D N A 中擴增出Y bw b b L 基因：( 2 ) 將T bw b b L 基因克隆到p M D l 8 - T 克隆載體中，經D N A 序列測定證實為正確的基因；( 3 ) 將T bw b b L 基因亞克隆到p E T l 6 b 表達載體中并通過改變不同的誘導條件在大腸桿菌B L 2 1 ( D E 3 ) 中表達T bW b b L 蛋白質；(

3、4 ) 建立在B L 2 l ( D E 3 ) 大腸桿菌中共表達T b W b b L 蛋白質與分子伴侶的體系，優(yōu)化表達條件以高效表達出可溶性T bW b b L蛋白質；( 5 ) 用W e s t e r nb l o t 方法鑒定所表達的T bW b b L 蛋白質為T b w b b L 基因產物。本論文所獲得的結果如下：1 + 利用P C R 方法擴增出正確的目的w b b L 基因從結核分枝桿菌H 3 7 R v 菌株基因組

4、數據庫f h t t p ：／／g e n o l i s t ．p a s t e u r ．f r ／T u b e r c u L i s t ／) 中獲得T bw b b L 基因的核瞢酸序列( 9 0 6b p ) 。根據其核苷酸序列設計一對P C R 引物，并在上游引物和下游引物的5 ’端分別引入了N d eI 和B a m H I 限制性內切酶位點。以便將w b b L 基因克隆到p E T l 6 b 表達載體的N d

5、e I 和B a m H I 位點。用具高保真性的L AT a qD N A 聚合酶，以H 3 7 R v菌株基因組D N A 為模板成功擴增了w b b L 基因。2 ．p M D l 8 ．T b w b b L 的構建及核苷酸序列測定將純化的P C R 產物與p M D l 8 ．T 載體進行連接，將連接產物轉化到大腸桿菌N o v a B l u e 菌株的感受態(tài)細胞中。用限制性內切酶酶切及P C R 方法鑒定出陽性重組質粒p