UMT作為紅色熒光報(bào)告蛋白在大腸桿菌的功能和可溶性表達(dá).pdf

1、尿卟啉原III甲基化酶（UMT）是血紅素和西羅血紅素分支合成途徑的關(guān)鍵酶。重組UMT在細(xì)胞中積累催化的紅色熒光物質(zhì)西羅葉綠三酸和三甲基咕啉，所以UMT是一種新型熒光報(bào)告蛋白。與綠色熒光蛋白相比，UMT的應(yīng)用研究報(bào)道較少。本文以大麥和玉米UMT作為報(bào)告蛋白，分別研究了不同條件對(duì)UMT以及UMT融合蛋白在大腸桿菌的表達(dá)水平，結(jié)果如下：
　　1.分析了定向進(jìn)化的重組大麥UMT功能，和野生型蛋白相比，表達(dá)突變體的大腸桿菌細(xì)胞熒光強(qiáng)度增加。

2、紫外可見光譜和熒光光譜掃描初步確定熒光物質(zhì)為西羅葉綠三酸和三甲基咕啉。
　　2.探明了不同溫度、IPTG濃度、啟動(dòng)子和不同菌株對(duì)表達(dá)兩種大麥UMT的細(xì)胞熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，不同條件下，突變體比野生型細(xì)胞熒光強(qiáng)度增加。
　　3.驗(yàn)證了兩種大麥UMT融合不同標(biāo)簽后蛋白表達(dá)的變化。ssrA融合表達(dá)的突變體在胞內(nèi)完全降解，而融合表達(dá)的野生型則聚集為包涵體；導(dǎo)肽pelB融合的野生型和突變體蛋白，和胞內(nèi)表達(dá)相比，熒光降低。

3、　　4.分析了不同菌株、分子伴侶以及5-氨基酮戊酸（ALA）對(duì)玉米UMT融合的MBP和TEVp突變體蛋白可溶性表達(dá)的影響。在不同菌株中，融合蛋白的熒光強(qiáng)度趨勢(shì)一致；共表達(dá)分子伴侶對(duì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度無顯著影響；添加外源ALA則影響了TEVp及其突變體融合蛋白的熒光強(qiáng)度。
　　5.分析了玉米UMT分別融合其它蛋白后可溶性表達(dá)水平的變化。UMT可以有效指示MBP和TEVp及其突變體的水溶性，但對(duì)重組玉米蛋白水溶性的結(jié)果不佳，這和部分蛋白用G

4、FP指示效果一致, N端SUMO標(biāo)簽對(duì)改善蛋白水溶性效果有限。
　　6.分析了玉米UMT作為雙功能報(bào)告蛋白篩選可溶性靶蛋白的效應(yīng)。表達(dá)UMT融合蛋白的大腸桿菌，菌落數(shù)量與一定濃度的亞碲酸鉀成反比，但在紫外光下觀察到紅色熒光的單菌落，質(zhì)粒經(jīng)酶切驗(yàn)證與預(yù)期分子量大小一致，SDS-PAGE和蛋白印跡驗(yàn)證了預(yù)期可溶性融合蛋白的表達(dá)。
　　7.分析了UMT上下游代謝相關(guān)酶對(duì)玉米UMT作為報(bào)告蛋白的影響。5-氨基酮戊酸合酶和尿卟啉原脫羧