結(jié)核分枝桿菌冷休克蛋白CspA的克隆、表達(dá)和性質(zhì)研究.pdf

1、冷休克蛋白是廣泛存在于各種微生物中的應(yīng)激蛋白，能夠增強(qiáng)細(xì)胞抵御冷激脅迫的能力，它屬于分子伴侶家族成員，結(jié)構(gòu)上富含芳香族氨基酸，通過(guò)結(jié)合單鏈核酸從而調(diào)控蛋白表達(dá)。大腸桿菌CspA家族是研究最早最深入的冷休克蛋白，其同源蛋白在嗜溫、嗜冷和嗜熱菌中均大量存在，并與真核生物的Y-box蛋白冷休克結(jié)構(gòu)域同源。近年來(lái)，曰益增長(zhǎng)的證據(jù)表明，冷休克蛋白尤其CspA對(duì)于病原菌致病、傳播以及應(yīng)對(duì)宿主免疫系統(tǒng)等起著重要的作用，然而，它們參與免疫和耐藥等的具體

2、機(jī)制至今尚未被完全闡明。國(guó)內(nèi)外關(guān)于該類蛋白參與致病和藥敏的報(bào)道較多集中于金黃色葡萄球菌，在結(jié)核分枝桿菌中的報(bào)道僅局限于蛋白的體外免疫研究，最近有報(bào)道冷休克蛋白CspA參與大腸桿菌生物膜的形成，而生物膜又與致病菌的抗藥和持續(xù)性感染有密切關(guān)系，因而研究該類蛋白將有利于抗致病菌藥物的開(kāi)發(fā)。 結(jié)核病的全球流行使得尋找新的藥靶蛋白迫在眉睫，結(jié)核分枝桿菌中的冷休克蛋白CspA，它屬于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)上清中的濾液蛋白(culture filt

3、rate protein，CFP)，為一種可能的T細(xì)胞抗原。根據(jù)NcBI公布的冷休克蛋白CspA基因序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，對(duì)結(jié)核分枝桿菌基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得與預(yù)期204bp大小相符的DNA片段，經(jīng)序列測(cè)定確認(rèn)為目的基因。 將該片段克隆至原核表達(dá)載體pET32a(+)得到重組質(zhì)粒pCspA-pET32，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)；表達(dá)的CspA融合蛋白采用兩種純化方法，一是經(jīng)過(guò)Ni<'2+>-

4、Sepharose親合柱對(duì)蛋白進(jìn)行柱層析純化，二是通過(guò)對(duì)結(jié)核分枝桿菌CspA的重組菌進(jìn)行專一性粗提硫氧還蛋白的“滲透休克法”和傳統(tǒng)生化蛋白提純方法“硫酸銨沉淀”相結(jié)合來(lái)純化，通過(guò)滲透休克法得到目的重組蛋白粗提液，后采用20～60％的不同硫酸銨飽和梯度進(jìn)行鹽析，沉淀CspA，再通過(guò)SDS-PAGE電泳分析及紫外吸收法測(cè)蛋白含量，發(fā)現(xiàn)滲透休克法結(jié)合30％飽和度的硫酸銨鹽析，CspA沉淀量最大。并且兩種純化方法對(duì)比，可見(jiàn)滲透休克結(jié)合硫酸銨純化

5、蛋白的方法其效果接近于柱層析，并且成本較低，適用于工業(yè)生產(chǎn)和規(guī)模化放大。 純化的蛋白通過(guò)胰蛋白酶消化法鑒定生物學(xué)活性，重組CspA中加入長(zhǎng)度為35bp的單鏈DNA，然后在30℃條件下，用胰蛋白酶進(jìn)行消化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入單鏈DNA的重組蛋白比起未加單鏈DNA的重組蛋白，前者受到胰蛋白酶切割能力明顯減弱，切割的半衰期顯著增加，由此可見(jiàn)，正是結(jié)合了單鏈核酸，才對(duì)蛋白起到了保護(hù)作用，證明重組蛋白CspA是具有結(jié)合單鏈DNA的分子伴侶活性

6、。研究重組質(zhì)粒pCspA-pET32對(duì)宿主菌BL21(DE3)的影響，可知重組蛋白可以增強(qiáng)宿主菌對(duì)微量卡那霉素的敏感性。對(duì)CspA蛋白進(jìn)行了相關(guān)結(jié)構(gòu)研究。通過(guò)Signal P軟件分析結(jié)核菌CspA，發(fā)現(xiàn)作為結(jié)核菌分泌蛋白，該蛋白卻不含典型的信號(hào)肽序列，這點(diǎn)也與文獻(xiàn)報(bào)道相符。圓二色譜測(cè)定重組CspA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并與載體pET32a(+)表達(dá)蛋白進(jìn)行對(duì)照，發(fā)現(xiàn)重組蛋白CspA在遠(yuǎn)紫外區(qū)域的橢圓率是低于對(duì)照載體蛋白，因?yàn)镃spA的 a-螺旋區(qū)

7、域更短。載體蛋白最高峰值在195 nm處，而重組蛋白CspA卻發(fā)生了紅移，最高峰在197 nm出現(xiàn)，遷移的原因即來(lái)源于重組蛋白CspA的反向平行的β-折疊。然而，兩者的圓二色譜圖仍然表現(xiàn)出極大的相似性，由此可見(jiàn)，重組蛋白中新插入的基因表達(dá)的蛋白并未顯著影響載體蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)圓二色譜實(shí)際測(cè)定的結(jié)果也與通過(guò)軟件測(cè)定的結(jié)果一致。以大腸桿菌的CspA的晶體結(jié)構(gòu)作為模板對(duì)照，通過(guò)同源建模，得到了結(jié)核菌CspA的三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)物種的Cs