鴨源性e.coli耐藥相關基因mrna表達差異分析及中藥對e.coli耐藥性的消除試驗

1、西南大學碩士學位論文鴨源性E.coli耐藥相關基因mRNA表達差異分析及中藥對E.coli耐藥性的消除試驗姓名：張奎申請學位級別：碩士專業(yè)：預防獸醫(yī)學指導教師：聶奎20090501兩南大學碩+ 學何論文7 5 ％) 。2 鴨源性E ．c o l i 耐藥株a p h A 和H S P 7 0 基因m R N A 的表達差異分析磷酸轉移酶是E ．c o l i 產生對氨基糖苷類藥物耐藥的3 種鈍化酶之一，其中a p h A 基岡編碼的磷酸

2、轉移酶能磷酸化卡那霉素、新霉素、巴龍霉素和丁酰苷菌素，導致E ．c o l i 對這類抗生素耐藥。試驗構建了重組質粒a p h A - p M D l 9 - T 、含H S P 7 0 基因的重組質粒H S P 7 0 一p M D l 9 一T 以及含有管家基因G A P D H 的重組質粒G A P D H - p M I ) 1 9 - T ，將其作為標準品進行R e a lT i m e P C R ，得到較好的的擴增曲線、標

3、準曲線和融解曲線，能準確地對樣本中a p h A 和H S P 7 0 基因m R N A 表達最進行相對定量。經R e a l T i m eR T - P C R 檢測，發(fā)現(xiàn)E ．c o l i 耐藥菌株的耐藥基岡m R N A 的表達量是敏感菌株的1 2 0 2 倍，說明其耐藥基因a p h Am R N A 表達量的上調，可能是介導該耐藥菌株對氨基糖苷類藥物耐藥的主要因素；并且耐藥菌株的H S P 7 0 基因m R N A 的

4、表達量是敏感菌株的3 4 ．2 1 倍，表明E ．c o l i 在抗菌藥物的脅迫下，熱休克蛋白表達量增加，提高E ．c o l i 的耐受性，對E ．c o l i 具有保護作用。本文認為，可把H S P 7 0 作為分子生物標志用于E ．c o l i 耐藥性的分子流行病學調查。3 中藥單體對鴨源性E ．c o l i 耐藥性的消除試驗選取6 種中藥單體( 苦參堿、鹽酸小檗堿、青蒿素、青藤堿、吳茱萸堿、丹參酮I I A ) ，以兩種

5、化學藥物( 格列本脲、S D S ) 為對照，采用藥物傳代培養(yǎng)試驗，對臨床分離的鴨源耐藥性大腸桿菌進行耐藥性消除試驗。經M I C 檢測，發(fā)現(xiàn)S D S 、格列本脲、苦參堿、鹽酸小檗堿和青蒿素對試驗菌株的M I C 分別為2 0 0 、1 0 0 、5 0 0 、2 5 0 和5 0 0 I ．t g ／m L ，而青藤堿、吳茱萸堿、丹參酮I I A 對試驗菌株無抑菌作用；藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，6 種中藥單體能恢復E ．c o l i 耐藥菌株

6、對氨曲南、復達欣、阿米卡星、妥布霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星和利福平的敏感性。通過對6 種中藥單體傳代菌株部分耐藥基因的P C R 檢測，發(fā)現(xiàn)這6 種中藥單體不能消除氦基糖苷類耐藥基因r p s L 和整合酶基因f n f I ，鹽酸小檗堿、青蒿素、青藤堿和丹參酮I I A 不能消除p ．內酰胺類耐藥基因b l a T E M ，但苦參堿( 具有抑菌作片j ) 和吳茱萸堿( 無抑菌作用)能消除p ．內酰胺類耐藥基因b l a T E

7、 M ，說明無抑菌作用的中藥單體也能消除耐藥菌株的部分耐藥基因。對藥物傳代菌株a p h A 基因m R N A 表達水平的檢測發(fā)現(xiàn)，6 種中藥單體能不同程度地降低耐藥菌株a p h A 基因m R N A 的表達量，可以看出無抑菌作用的中藥單體也可以消除耐藥菌株的耐藥性，表明中藥消除耐藥性不僅僅是通過抑菌作用，而且還存在其他的耐藥消除機制。關鍵詞：鴨；大腸桿菌；H S P 7 0 ；a p h A ；基因表達差異；中藥；耐藥性消除；I