版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、上海第二醫(yī)科大學博士學位論文人卵泡抑素基因克隆及其在P.pastoris和E.coli中的表達姓名:尤漢寧申請學位級別:博士專業(yè):內科學(消化系疾?。┲笇Ы處煟豪疃▏?0040401二、人F S 基因在戶p a s t o r i s 中的表達我們以P M D l 8 - T —F S 3 1 7 為模板,采用P f uD N A 聚合酶,通過P C R 的方法擴增目的基因片段,通過X h o I 和&D R j 限制性內切酶將編碼F
2、S 2 8 8 的基因片段亞克隆入p P I C 9 ,構建p P I C 9 一F S 2 8 8 ,轉化T o p l O 感受態(tài),轉化子驗證后進行D N A序列測定,將測序結果進行B l a s t 分析后,將p P I C 9 一F S 2 8 8 采用B a m H I 和S a l i 雙酶切,回收小片段后,連接經(jīng)B a m H I 和S a l I 雙酶切的p P I C 9 K ,構建采用f l 因子信號肽的重組分泌型表
3、達載體p P I C 9 K .F S 2 8 8 ,通過電穿孔法轉化S M D l l 6 8 ,G 4 1 8篩選多拷貝轉化子。將轉化子發(fā)酵后,取上清液進行S D S .P A G E 和W e s t e m - b l o t分析。結果發(fā)現(xiàn),P p a s t o r i s 工程菌能分泌表達重組人F s ,分子量在5 0 ~6 0 K D之間,但其表達量不高,難以滿足蛋白純化要求。三、人F s 基因在E c o l i 中的融
4、合表達我們采用P C R 法從P M D l 8 .T —F S 3 1 7 中擴增編碼F S 2 8 8 的基因片段,通過B a m H I 和X h o l 亞克隆到G S T 融合表達載體p G E X .5 X 一1 和H i s 融合表達載體p E T 一2 8 C ( 十) 中,構建G S T 融合表達載體p G E X - 5 X 。1 .F S 2 8 8 和H i s 融合表達載體p E T - 2 8 C - F S
5、 2 8 8 ,將p G E X 一5 X 一1 - F S 2 8 8 分別轉化大腸桿菌B L 2 1 和O r i g a m i B ,經(jīng)選擇性平板篩選獲得重組轉化子,轉化予發(fā)酵,菌體經(jīng)超聲破菌離心后,將上清液和沉淀分別進行S O S —P A G E 分析,結果發(fā)現(xiàn),融合表達蛋白大小為5 8 K D ,以包涵體形式存在。將H i s 融合表達載體p E T - 2 8 C .F S 2 8 8 轉化大腸桿菌B L 2 1 ,將獲
6、得的轉化子發(fā)酵表達,通過S D S .P A G E 和W e s t e r nb l o t 分析發(fā)現(xiàn),融合蛋白大小為3 6 K D ,主要以包涵體存在,但有少量為可溶性蛋白。對G S T —F S 2 8 8 包涵體蛋自進行分離純化研究。將包涵體洗滌后,采用8 M 脲素溶解包涵體,通過C M —s e p h a r o s e 純化變性G S T .F S 2 8 8 融合蛋白,采用稀釋法進行包涵體蛋白的體外復性,結果發(fā)現(xiàn),變性
7、包涵體蛋白經(jīng)C M .s e p h a r o s e 后很容易得到純化,在體外復性過程中,蛋白的收率不高,但我們仍然獲得少量復性G S T - F S 2 8 8 融合蛋白樣品。四、重組人F S 2 8 8 及G S T —F S 2 8 8 融合蛋白的活性測定我們采用M T T 法檢測P p a s t o r i s 工程菌發(fā)酵上清液和復性G S T —F S 2 8 8 產(chǎn)品對A C TA 引起的K 5 6 2 細胞增殖的抑制
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 36691.canstatinn基因在e.coli和p.pastoris中表達及其活性分析
- 小鼠內抑素基因及其突變體在e.coli中的表達重組蛋白的復性和活性研究
- 茶樹花色素還原酶基因的克隆及其在e.coli中的表達
- a型口蹄疫病毒結構蛋白vp,1基因的克隆及其在e.coli中的表達
- 人補體調節(jié)蛋白mcp,daf基因在e.coli中的表達
- 綠木霉t.virenszy01中內切葡聚糖酶egiv基因的克隆及其在e.coli中過表達
- oifntau在e.coli中的可溶性表達及其活性的初步研究
- 血管抑素基因克隆及在e.colidh5α的表達
- 牛卵泡抑素cDNA的克隆及其原核表達.pdf
- 56010.hmt3在e.coli中的克隆表達、分離純化及其重金屬解毒作用初探
- 鴨源性e.coli耐藥相關基因mrna表達差異分析及中藥對e.coli耐藥性的消除試驗
- 水牛卵泡抑素(Follistatin)基因cDNA克隆及真核表達.pdf
- 凋亡抑制因子Survivin的基因克隆及其在Pichia pastoris中的表達.pdf
- 大鼠內皮抑素基因克隆及其在大腸桿菌中的表達.pdf
- 核心蛋白聚糖的基因克隆及其在Pichia Pastoris中的表達和活性測定.pdf
- 中藥對esbls陽性e.coli及其基因的干預性研究
- 草魚卵泡抑素(Follistatin)重復基因的克隆和功能研究.pdf
- 鼠內臟利什曼病治療和l.d.lack基因克隆表達及e.coli粘附因子研究
- 人內皮抑素基因的克隆、重組表達、純化和活性研究.pdf
- 大鼠甲狀腺激素受體β1cdna克隆及其在e.coli.中的表達
評論
0/150
提交評論