基于超聲預(yù)處理的谷朊蛋白ACE抑制肽制備及其過程原位監(jiān)測技術(shù)研究.pdf

1、小麥谷朊蛋白是一種非常有潛力的制備生物活性肽的植物蛋白源，其酶解產(chǎn)物可通過顯著地抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）的活性，而達到降低血壓的目的。但由于谷朊蛋白遇水易交聯(lián)形成粘彈性強的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)且分散性極差導(dǎo)致其酶解效率低。超聲波預(yù)處理底物蛋白可以通過改變蛋白的結(jié)構(gòu)而提高蛋白的酶解效率，但是超聲波預(yù)處理過程中底物蛋白結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化以及與酶解效率的關(guān)系還尚不清楚。超聲波預(yù)處理過程和蛋白酶解反應(yīng)過程還無法實現(xiàn)原位在線的監(jiān)測和終點的快速判斷。本文旨

2、在通過多模式超聲波預(yù)處理提高谷朊蛋白的酶解效率，建立超聲波預(yù)處理過程中蛋白結(jié)構(gòu)變化與酶解產(chǎn)物活性的定量分析模型；通過原位實時光譜技術(shù)，在超聲波預(yù)處理環(huán)節(jié)監(jiān)測谷朊蛋白受超聲波影響巰基（-SH）和二硫鍵（S-S）含量的變化規(guī)律，并在酶解反應(yīng)環(huán)節(jié)監(jiān)測谷朊蛋白的水解度（DH）、多肽濃度、ACE抑制率等主要指標的變化規(guī)律。主要研究結(jié)果如下：
　　（1）以谷朊蛋白的DH和酶解產(chǎn)物的ACE抑制率為指標，研究了多模式超聲波預(yù)處理對谷朊蛋白酶解特性

3、的影響，得出超聲波最佳工作模式和預(yù)處理參數(shù)。在改善谷朊蛋白酶解效果方面，同步雙頻工作模式優(yōu)于單頻工作模式，而交替雙頻工作模式又優(yōu)于同步雙頻工作模式。在最優(yōu)的交替雙頻工作模式下，超聲波最佳預(yù)處理參數(shù)為：頻率組合20-35 kHz、交替時間5s、超聲功率密度200 W/L、物料初始溫度30℃、料液濃度30 g/L、超聲處理時間10 min。經(jīng)交替雙頻超聲預(yù)處理后，谷朊蛋白的DH為12.51％、ACE抑制率為80.03%、IC50值為0.69

4、6 mg/mL、蛋白轉(zhuǎn)化率為75.4%。與未經(jīng)超聲波預(yù)處理的對比，交替雙頻超聲預(yù)處理使得谷朊蛋白的DH提高了2.37%、ACE抑制率提高了19.30%、IC50值下降了6.5%。通過研究交替雙頻超聲波預(yù)處理對酶解過程的影響發(fā)現(xiàn)，超聲波預(yù)處理可以使得酶解產(chǎn)物的ACE抑制率提前10 min達到其最大值。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因主要為超聲波預(yù)處理在酶解反應(yīng)的前期提高了分子量在200~1000 Da多肽的含量。
　　（2）利用原子力顯微鏡、紅外

5、光譜等技術(shù)手段，研究了超聲波頻率、功率密度和預(yù)處理時間對谷朊蛋白表面微觀結(jié)構(gòu)（微觀形貌和表面粗糙度）、納米力學(xué)特性（楊氏模量和黏附力）、分子結(jié)構(gòu)（巰基含量-SH、二硫鍵含量S-S、表面疏水性H0和二級結(jié)構(gòu)）的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：超聲波破壞了谷朊蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，適當?shù)某暡A(yù)處理使得蛋白分子分布更加均勻，表面粗糙度變大；過長的預(yù)處理時間（>10 min）或者過大的超聲波預(yù)處理功率密度（>200 W/L）又使得蛋白分子重新聚集折疊，表面粗糙度也

6、有所下降，不利于蛋白分子的酶解；超聲波預(yù)處理使得蛋白表面的納米力學(xué)特性重新分布，蛋白表面的平均楊氏模量和平均黏附力下降；超聲波預(yù)處理均使得谷朊蛋白的-SH含量、S-S含量、H0、二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，主要體現(xiàn)為-SH、S-S、H0的提高和α-螺旋含量減少。
　?。?）通過皮爾森相關(guān)性分析、主成分分析、逐步多元線性回歸分析等方法，研究了超聲預(yù)處理過程中底物蛋白結(jié)構(gòu)表征與酶解產(chǎn)物ACE抑制率的關(guān)系。相關(guān)性分析顯示，谷朊蛋白的-SH含量、表

7、面粗糙度（Ra，Rq）、H0與蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率有顯著（P＜0.05）的正相關(guān)關(guān)系，α-螺旋、平均楊氏模量、黏附力與蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率在有顯著（P＜0.05）的負相關(guān)關(guān)系。主成分分析選取了3個主成分表示原始各結(jié)構(gòu)含量在樣品中的79.628%的信息。第一主成分為蛋白的-SH含量、平均黏附力、Ra、Rq、H0；第二主成分主要為β-折疊和無規(guī)則卷曲；第三主成分主要為蛋白質(zhì)的S-S含量。α-螺旋與蛋白的楊氏模量和黏附力有很高的相

8、關(guān)程度。逐步回歸分析方程所建立的方程為 ACE抑制率=86.361+6.841（-SH）-0.687（α-螺旋）-0.162（S-S），R2為0.9380此方程可以用來反映谷朊蛋白酶解底物結(jié)構(gòu)表征與產(chǎn)物ACE抑制率之間的定量關(guān)系。
　　（4）建立了谷朊蛋白超聲波預(yù)處理過程的原位實時光譜監(jiān)測系統(tǒng)和光譜采集方法，可以穩(wěn)定地采集到超聲波預(yù)處理過程中谷朊蛋白的原位近紅外光譜信息。對超聲波預(yù)處理過程中的原位光譜進行了標準正態(tài)變換（SNV）、

9、多元散射校正（MSC）、一階導(dǎo)數(shù)（1st Derivative）和二階導(dǎo)數(shù)（2nd Derivative）四種方法的預(yù)處理。權(quán)衡考慮校正模型和預(yù)測模型的相關(guān)系數(shù)和均方根誤差大小，篩選出最優(yōu)子區(qū)間。在最優(yōu)光譜區(qū)間的基礎(chǔ)上研究原位實時光譜反應(yīng)系統(tǒng)結(jié)合線性模型聯(lián)合區(qū)間最小二乘法（Si-PLS）和誤差反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（BP-ANN）建立超聲波預(yù)處理過程中-SH、S-S含量的校正模型。結(jié)果顯示，最佳的光譜預(yù)處理方法為SNV。-SH含量的最佳聯(lián)合區(qū)

10、間為869~947、1207~1284、1458~1536和2205~2274 nm。S-S的最佳區(qū)間為933~992、1388~1446、2091~2148和2217~2274 nm。在最優(yōu)區(qū)間的基礎(chǔ)上非線性模型Si-BP-ANN的預(yù)測效果優(yōu)于線性模型Si-PLS。最終，對于-SH含量，預(yù)測集的相關(guān)系數(shù)Rp為0.9113，均方根誤差RMSEP為0.38μmol/g。對于S-S含量，預(yù)測集的Rp為0.7523，均方根誤差RMSEP為6.

11、56μmol/g。
　?。?）建立了谷朊蛋白酶解過程的原位實時光譜監(jiān)測系統(tǒng)和光譜采集方法。對酶解液的近紅外光譜進行了SNV、MSC、1st Derivative和2nd Derivative四種方法的預(yù)處理。利用聯(lián)合區(qū)間最小二乘法 Si-PLS建立模型，以模型的相關(guān)系數(shù)和均方根誤差作為衡量指標，篩選出了建模的最佳光譜區(qū)間。結(jié)果顯示，SNV預(yù)處理后光譜的建模效果最好。DH的最佳聯(lián)合區(qū)間為1129.1~1200.4、1439.2~15

12、09.9、1976.3~2046.2和2128.6~2198.2 nm；多肽濃度的最佳聯(lián)合區(qū)間為1586.9~1644.6、1766.1~1817.1、2166.6~2217.2和2337.2~2387.7 nm；ACE抑制率的最佳聯(lián)合區(qū)間為1168.0~1252.1、1798.0~1880.9、1887.2~1969.9和2337.2~2412.9 nm。利用最佳光譜區(qū)間建立了谷朊蛋白 DH、酶解液多肽濃度和ACE抑制率的Si-PLS

13、回歸模型。DH預(yù)測模型的Rp為0.9570，RMSEP為1.73％；多肽濃度預(yù)測模型的Rp為0.9840，RMSEP為0.79 mg/mL；ACE抑制率預(yù)測模型的Rp為0.9536，RMSEP為5.12％。
　　以上研究結(jié)果表明：交替雙頻超聲波預(yù)處理可以顯著地提高谷朊蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率。酶解產(chǎn)物ACE抑制率的提高主要是由于超聲波預(yù)處理提高了-SH含量、降低了谷朊蛋白的α-螺旋相對百分含量、平均楊氏模量和平均黏附力，其中-S