預處理對酶解過程中膠原ACE抑制肽釋放影響研究.pdf

1、膠原蛋白三螺旋區(qū)域含有豐富的ACE抑制活性肽段，然而膠原三螺旋區(qū)異常穩(wěn)定，不易被金屬基質蛋白酶以外的蛋白酶降解，為暴露出更多酶切位點，促進ACE抑制肽段在普通蛋白酶作用下快速釋放，在膠原蛋白水解前通常需進行預處理。目前尚無專門針對預處理促進膠原ACE抑制肽快速釋放的研究報道。本研究旨在探究出一種簡單易行且可高效制備膠原ACE抑制肽的預處理方式，并對其作用機制進行深入研究。試驗研究了酸、堿、熱、超聲、超高壓5種預處理方式單獨作用與超聲和酸

2、堿協(xié)同作用對膠原ACE抑制肽釋放的影響，并對水解液中ACE抑制肽進行分離純化與序列鑒定。
　　以無處理組為對照，采用酸、堿、熱、超聲、超高壓預處理膠原蛋白，隨后進行酶解，對不同時間點水解液的水解度、ACE抑制率和分子量分布及預處理后膠原蛋白的熱穩(wěn)定性和結構進行研究分析。結果發(fā)現(xiàn)，5種預處理方式對膠原蛋白的水解均有促進作用，而對ACE抑制率的影響因處理方式而異，其中超聲處理、堿處理組水解液ACE抑制活性高且ACE抑制肽段釋放速率快。

3、結合酶解液多肽分子量分布及預處理后豬皮膠原的DSC、FIRT結果得出，堿處理破壞了膠原的非共價鍵平衡，改變了膠原構象特點，其螺旋區(qū)域的酶切位點被充分暴露，經(jīng)蛋白酶解后可得到更多源于螺旋區(qū)域的ACE抑制肽;超聲處理破壞了膠原中部分共價交聯(lián)，使多肽鏈伸展或內(nèi)部疏水性基團外露，暴露出更多疏水性位點，有利于堿性蛋白酶的酶解;其他處理方式破壞的可能大多是膠原非螺旋區(qū)，對膠原三螺旋區(qū)域酶切位點的暴露促進程度有限。
　　基于前期的研究，將超聲與

4、酸堿處理相結合對膠原進行預處理，結果顯示超聲協(xié)同酸堿預處理較前期各預處理方式更有利于膠原ACE抑制肽的快速釋放，酶解1min時二者ACE抑制率均達88％以上，高于前期各處理方式酶解4h的水平，比較發(fā)現(xiàn)，超聲協(xié)同堿較超聲協(xié)同酸處理組ACE抑制肽釋放速率更快。結合分子量分布及DSC、紅外光譜結果分析發(fā)現(xiàn)，超聲協(xié)同酸處理更多破壞了膠原分子間的共價交聯(lián)，而超聲協(xié)同堿主要破壞了維系三螺旋構象的氫鍵進而改變膠原亞基分子的構象，對共價鍵影響不大，且后

5、者對三螺旋區(qū)酶切位點的暴露較前者更為明顯。掃描電鏡結果顯示，堿液可破壞膠原蛋白，但破壞僅限于膠原蛋白表面，在超聲協(xié)同堿的作用下，膠原蛋白形成了小顆粒，這可能增大了膠原的比表面積，使之暴露出更多酶切位點，有利于酶解進行。
　　采用SephadexG-15、半制備高效液相色譜對超聲協(xié)同堿處理酶解30min的樣品進行分離純化，純化后的樣品進行序列鑒定。其中SephadexG-15分離膠原ACE抑制肽的最佳分離條件為:樣品濃度100mg/

6、mL;上樣量2mL;流速2mL/min;洗脫劑為蒸餾水;層析柱為1m×10mm的層析柱。在該分離條件下，混合肽被分成AP-Ⅰ、AP-Ⅱ兩個組分，IC50值分別為19.501、1.005mg/mL。對抑制活性較強的AP-Ⅱ進一步采用半制備高效液相色譜進行分離，其最佳分離條件為柱溫30℃，進樣43.5μL（濃度10mg/mL），流速4.35mL/min，采用10％乙腈(含0.05％TFA)等度洗脫40min。半制備后得到8個組分峰，其中峰5