甾醇C-4脫甲基多酶體系中Erg28p蛋白的生物學(xué)功能及作用機(jī)制研究.pdf

1、釀酒酵母細(xì)胞膜中含有豐富的甾醇類活性物質(zhì)，是活性維生素D及激素類藥物的重要中間體。生物甾醇合成代謝中，甾醇C-4位脫甲基反應(yīng)過程復(fù)雜，是甾醇活化的關(guān)鍵步驟，涉及了三步連續(xù)的氧化還原反應(yīng)，在ERG25基因表達(dá)的C-4氧化酶(SMO)，ERG26基因表達(dá)的C-3脫羧酶(3βHSD/D)及ERG27基因表達(dá)的C-3酮還原酶(3SR)的催化下，C-4位的甲基被特異性的氧化，脫羧，鄰位的酮基還原為羥基后進(jìn)行新一輪的脫甲基反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)C-4位雙甲

2、基的脫除。C-4脫甲基酶復(fù)合體中，除了Erg25p、Erg26p和Erg27p以外，另有一個(gè)跨膜支架蛋白Erg28p，其在麥角甾醇合成代謝中的相關(guān)研究相對較少。本課題擬采用酵母真核表達(dá)系統(tǒng)，研究酵母麥角甾醇合成通路中支架蛋白Erg28p在協(xié)助甾醇C-4脫甲基多酶體系中其他亞基的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜正確定位及催化界面的有效形成中的生物學(xué)功能及關(guān)鍵作用位點(diǎn)，具體研究內(nèi)容如下:
　　本論文的第一部分內(nèi)容通過loxP-Marker-loxP序列組件及

3、Cre-loxP系統(tǒng)，建立ERG28基因敲除的釀酒酵母細(xì)胞模型（BY4741/△ERG28），檢測了野生菌BY4741和敲除菌BY4741/△ERG28的干重，結(jié)果顯示ERG28基因的敲除顯著抑制了釀酒酵母的生長。構(gòu)建了Erg28p蛋白表達(dá)載體(pYES2-ERG28)，并在BY4741/△ERG28菌株中轉(zhuǎn)染pYES2-ERG28，建立回復(fù)表達(dá)ERG28基因的菌株(BY4741/△ERG28-pYES2-ERG28)，為研究Erg28

4、p蛋白在甾醇合成代謝中的生物學(xué)功能建立細(xì)胞模型基礎(chǔ)。
　　本論文第二部分研究內(nèi)容分析了Erg28p蛋白的生物學(xué)功能。利用氣相質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法分析了BY4741/△ERG28菌株和野生菌株細(xì)胞膜上麥角甾醇代謝組分及含量的差異，發(fā)現(xiàn)敲除菌BY4741/△ERG28中麥角甾醇的前體產(chǎn)生累積，終產(chǎn)物麥角甾醇含量顯著降低，證實(shí)麥角甾醇合成通路被阻斷;在回復(fù)表達(dá)ERG28基因的菌株BY4741/△ERG28-pYES2-ERG28中，

5、麥角甾醇代謝通路的前體累積物質(zhì)被重新去除，終產(chǎn)物麥角甾醇得到累積，從正反兩個(gè)方向證實(shí)Erg28p蛋白參與釀酒酵母麥角甾醇合成代謝。此外，分別構(gòu)建了GFP與Erg25p，Erg26p，Erg27p及Erg28p的融合表達(dá)載體，考察了Erg28p蛋白在C-4脫甲基多酶復(fù)合物中分子作用機(jī)制，證實(shí)Erg28p蛋白輔助C-4脫甲基多酶體系中其他亞基的蛋白折疊及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的定位，從而影響C-4甾醇脫甲基反應(yīng)。
　　本論文第三部分通過生物信息學(xué)方