三苯氧胺在乳腺癌細胞中的生物學功能及其機制的研究.pdf

1、目的：
　　研究三苯氧胺對乳腺癌細胞MCF-7生長及其放射敏感性的影響，探討三苯氧胺對BTG1基因的調控作用，發(fā)現(xiàn)乳腺癌新的治療靶點。
　　方法：
　　選用人乳腺癌MCF-7(ER+)、MDA-MB-435(ER-)細胞系作為研究對象。
　　(1)采用CCK-8法檢測三苯氧胺對乳腺癌細胞MCF-7(ER+)、MDA-MB-435(ER-)的增殖的影響。
　　(2)采用體外劃痕愈合實驗觀察三苯氧胺對乳腺癌細胞

2、遷移能力的影響，transwell小室侵襲試驗觀察三苯氧胺對乳腺癌細胞侵襲能力的影響。
　　(3)采用流式細胞術觀察三苯氧胺對乳腺癌細胞周期的影響，磷脂酰絲氨酸外翻法（AnnexinⅤ和PI雙染法）檢測三苯氧胺對乳腺癌細胞凋亡的影響。采用JC-1檢測試劑盒檢測細胞線粒體跨膜電位。
　　(4)采用活性氧(ROS)檢測試劑盒、ATP含量檢測試劑盒等，檢測三苯氧胺對乳腺癌細胞中ROS和ATP能量代謝指標變化的影響。
　　(5

3、)采用Western blot法檢測三苯氧胺對乳腺癌細胞中周期凋亡相關蛋白及BTG1蛋白表達的影響。
　　(6)細胞克隆形成法檢測三苯氧胺對乳腺癌細胞放射敏感性的影響。
　　(7)采用細胞流式術檢測三苯氧胺聯(lián)合電離輻射對乳腺癌細胞周期及細胞凋亡的影響。采用Western blot法檢測三苯氧胺聯(lián)合電離輻射對乳腺癌細胞周期相關蛋白表達的影響。
　　(8)采用單細胞凝膠電泳和γ H2AX免疫熒光檢測三苯氧胺聯(lián)合電離輻射對乳

4、腺癌細胞照射后DNA損傷修復能力的影響。
　　(9)采用活性氧(ROS)檢測試劑盒檢測三苯氧胺聯(lián)合電離輻射對乳腺癌細胞中ROS的影響。
　　(10)構建pcDNA-BTG1真核表達載體，應用脂質體轉染到乳腺癌MCF-7細胞中，建立穩(wěn)定轉染BTG1MCF-7細胞株，采用RT-PCR和Western Blot法檢測細胞克隆中BTG1的mRNA和蛋白表達水平，并對細胞的遺傳穩(wěn)定性進行鑒定。
　　(11)熒光定量PCR檢測三苯

5、氧胺聯(lián)合電離輻射對乳腺癌細胞中BTG1的mRNA表達水平影響。
　　(12) Western blot法檢測三苯氧胺聯(lián)合電離輻射對乳腺癌細胞BTG1蛋白表達的影響。
　　結果：
　　(1)三苯氧胺可明顯抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-435細胞的生長，且呈現(xiàn)顯著的時間-劑量依賴關系。MDA-MB-435細胞24或48小時的IC50分別為:2.3μmol/L、1.7μmol/L，MCF-7細胞24小時的IC50為1.

6、2μmol/L。
　　(2)三苯氧胺作用后，乳腺癌MCF-7的侵襲能力同樣受到了明顯的抑制，且呈現(xiàn)劑量依賴關系。但三苯氧胺不能明顯抑制MDA-MB-435細胞的體外侵襲能力。
　　(3)三苯氧胺可引起乳腺癌MCF-7細胞G2/M期阻滯。
　　(4)不同濃度三苯氧胺可誘導乳腺癌MCF-7細胞不同程度的凋亡，且與藥物濃度具有良好的相關性。三苯氧胺作用后乳腺癌MCF-7細胞線粒體膜電位下降，啟動線粒體凋亡途徑。三苯氧胺可誘導

7、乳腺癌MCF-7細胞中促凋亡蛋白Bax的表達增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達下降，caspase-3蛋白的表達隨著三苯氧胺濃度增加而降低。
　　(5)三苯氧胺可誘導乳腺癌MCF-7細胞中ROS的爆發(fā)。ROS可抑制乳腺癌細胞生長作用，且這種抑制作用可被ROS清除劑所緩解。
　　(6)三苯氧胺可誘導乳腺癌MCF-7細胞中BTG1表達隨著三苯氧胺濃度增加而增高。
　　(7)三苯氧胺對乳腺癌MCF-7細胞具有明顯的放射增敏作

8、用，增敏比為1.54。
　　(8)三苯氧胺聯(lián)合電離輻射，乳腺癌MCF-7細胞發(fā)生了顯著的G2/M期阻滯，說明三苯氧胺與電離輻射對細胞周期阻滯具有一定的協(xié)同作用。三苯氧胺作用于照射后的乳腺癌ER陽性細胞可通過抑制cyclinB1、cyclinD1和CDC2，從而誘導G2/M期阻滯，而提高其放射敏感性。
　　(9)三苯氧胺聯(lián)合電離輻射，促進乳腺癌MCF-7細胞凋亡，提高其放射敏感性。
　　(10)加入三苯氧胺后，照射后乳腺

9、癌MCF-7細胞中的γ H2AX位點明顯增多，意味著三苯氧胺可加重照射后的乳腺癌ER陽性細胞DNA損傷程度，且DNA損傷后修復能力也明顯降低，從而提高其放射敏感性。
　　(11)三苯氧胺聯(lián)合電離輻射，促進乳腺癌MCF-7細胞ROS釋放，提高其放射敏感性。
　　(12)三苯氧胺聯(lián)合電離輻射，調控乳腺癌MCF-7細胞BTG1表達，提高其放射敏感性。
　　結論：
　　(1)三苯氧胺可有效地抑制乳腺癌ER陽性細胞的生長、

10、轉移及侵襲。
　　(2)三苯氧胺可通過降低cyclin B1/cyclin D1的表達顯著誘導乳腺癌ER陽性細胞G2/M期阻滯。
　　(3)三苯氧胺可誘導乳腺癌ER陽性細胞內ROS爆發(fā)，并通過OXPHOS引起線粒體途徑凋亡。
　　(4)三苯氧胺可誘導乳腺癌細胞內ROS爆發(fā)，并通過OXPHOS引起線粒體途徑凋亡。
　　(5)三苯氧胺可增加乳腺癌ER陽性細胞的放射敏感性，其機制與細胞G2/M期阻滯相關;與ROS增加，