APOBEC3基因家族的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、腫瘤發(fā)生的過(guò)程中涉及多種基因的異常，基因組不穩(wěn)定性是造成腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵，其中占人體基因組的17％的LINE-1(L1)被認(rèn)為在此過(guò)程中起著重要的作用。L1是自主性逆轉(zhuǎn)座子，在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中被認(rèn)為是早期整合到基因組中的內(nèi)病毒。L1有兩個(gè)開(kāi)放的閱讀框架(ORF)，編碼蛋白包括ORF-1p和ORF-2p兩個(gè)蛋白，其中ORF-2p具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，而ORF-1p的功能仍不清楚，L1逆轉(zhuǎn)座子的激活幾乎在所有癌癥中均能檢測(cè)到，是導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性

2、的主要因素，其與癌癥發(fā)生密切相關(guān)。正因如此，細(xì)胞在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了對(duì)LINE-1嚴(yán)格的限制措施，如通過(guò)對(duì)其啟動(dòng)子的超甲基化，抑制其激活，但細(xì)胞在應(yīng)激條件仍可導(dǎo)致其激活，針對(duì)這種狀況，細(xì)胞中的APOBEC3家族(A3s，包括A3B，A3C，A3F，A3G，A3H)被發(fā)現(xiàn)可通過(guò)造成DNA突變的方式，實(shí)現(xiàn)對(duì)其活性的限制。A3s家族基因是一類(lèi)具有功能的應(yīng)激應(yīng)答基因，當(dāng)細(xì)胞受到病毒等應(yīng)激刺激，可促進(jìn)其基因的表達(dá)，該家族基因的作用機(jī)制是造成單鏈

3、DNA中的TCW（W代表A或者T）處的胞嘧啶脫氨，結(jié)果使胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?，從而?dǎo)致DNA序列的突變。研究發(fā)現(xiàn)A3s在限制LINE-1基因活性以及一些逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的同時(shí)，也會(huì)造成細(xì)胞基因組的其它基因的突變，這樣LINE-1與A3s基因家族的之間博弈，很有可能是導(dǎo)致腫瘤基因組出現(xiàn)高頻率突變的原因，為此，我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探索A3s對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特征的影響以及可能的作用機(jī)制。
　　目的:研究A3s基因家族對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特征的影響以及在腫

4、瘤發(fā)生過(guò)程中的作用及其作用機(jī)制。
　　方法:(1)從Hela細(xì)胞或A549細(xì)胞中提取RNA，通過(guò)RT-PCR方法制備A3s基因，測(cè)序證實(shí)后連接到表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上。(2)在探究A3s的生物學(xué)功能方面，將構(gòu)建的A3s基因重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到人胚腎細(xì)胞HEK293中，使用WesternBlot鑒定其表達(dá)，分別通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、CCK-8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析其對(duì)HEK293細(xì)胞遷移、增殖、細(xì)胞凋亡和周期的影響。(3) A

5、3s在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的作用及其作用機(jī)制的研究方面:本研究探索了A3s家族蛋白與L1ORF1p之間形成蛋白復(fù)合體的可能性，由于L1ORF1p為RNA結(jié)合蛋白，進(jìn)一步探索RNA在其中的作用。在探索其對(duì)重要癌相關(guān)基因的致突變研究中，通過(guò)共轉(zhuǎn)染A3s家族基因以及TP53基因及其啟動(dòng)子區(qū)、K-RAS基因后，采用3D-PCR(Differential DNADenaturation PCR)檢驗(yàn)突變情況。
　　結(jié)果:通過(guò)對(duì)A3s基因家族的實(shí)驗(yàn)

6、，我們發(fā)現(xiàn):
　　A3s基因的生物學(xué)功能:(1)CCK-8結(jié)果顯示，A3B、A3C、A3F、A3G過(guò)表達(dá)能明顯促進(jìn)HEK293細(xì)胞的體外增殖能力。與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相比，HEK293細(xì)胞的體外增殖能力得到極顯著提高(P＜0.01)，增長(zhǎng)率分別為19.5％、19.9％、18.9％、15.7％;(2)AnnexinⅤ-FITC、PI染色和流式細(xì)胞儀分析表明，A3B、A3C、A3F、A3G過(guò)表達(dá)能夠抑制HEK293細(xì)胞的凋亡，在轉(zhuǎn)染72h后，

7、HEK293細(xì)胞的凋亡率分別為10.53％、19.02％、12.54％、13.95％，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的凋亡率為21.31％;(3)PI染色和流式細(xì)胞儀分析表明A3B、A3C、A3F、A3H過(guò)表達(dá)能使HEK293細(xì)胞G0/G1期縮短，而S期延長(zhǎng)，促進(jìn)HEK293細(xì)胞周期，此結(jié)果與細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　　A3s基因介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制:(1)co-IP結(jié)果表明，A3C、A3F、A3G與L1ORF-1p存在相互作用關(guān)系，當(dāng)用RNA酶處理后

8、，發(fā)現(xiàn)這種相互作用消失，表明A3C，A3F，A3G與L1ORF-1p的相互作用是RNA介導(dǎo)的;(2)HEK293分別共轉(zhuǎn)染A3C，A3F，A3G與TP53、TP53的啟動(dòng)子區(qū)、K-RAS基因質(zhì)粒探究TP53、K-RAS基因突變的產(chǎn)生的機(jī)制，結(jié)果顯示A3s過(guò)表達(dá)可增加TP53結(jié)構(gòu)基因以及啟動(dòng)子區(qū)序列產(chǎn)生突變，而對(duì)K-RAS突變無(wú)明顯影響。(3)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示:A3F-HA能下調(diào)TP-53啟動(dòng)子活性，而A3G-HA能上調(diào)TP-53

9、啟動(dòng)子活性。
　　結(jié)論:上述結(jié)果證明，人胚腎HEK293細(xì)胞中A3s基因表達(dá)水平的升高可增強(qiáng)細(xì)胞的體外增殖，抑制細(xì)胞的凋亡，并造成周期的改變;機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，APOBEC3蛋白可通過(guò)RNA依賴(lài)的方式與LINE1ORF-1p發(fā)生相互作用，這為進(jìn)一步研究LINE1逆轉(zhuǎn)座子和A3s家族在腫瘤中的作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。此外，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)APOBEC3可能誘導(dǎo)TP53、TP53啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生基因突變，且能引起TP53啟動(dòng)子活性改變，而對(duì)K-RAS基