腫瘤相關蛋白MDMX和MUC1生物學功能及其機制研究.pdf

1、第一部分MDM2/MDMX復合物對p53蛋白的調控作用研究
　　腫瘤抑制蛋白p53作為一種轉錄因子可以在多種條件下被激活,通過調節(jié)下游基因的表達來調控細胞對應激條件做出的反應,例如細胞周期阻滯、細胞凋亡與衰老以及DNA損傷修復等,從而完成一系列生物學功能。P53的功能失活幾乎存在于所有人類腫瘤細胞中,其中在50％的腫瘤中存在p53基因的突變或缺失,其余50％則由于p53異常調控所致。在p53調控的蛋白中,MDM4和MDM2是最為主

2、要的兩個p53負性調控因子。
　　關于MDM2和MDMX對p53的調控機制一直存在爭議,其主要分歧在于兩個蛋白是以二聚體形式共同調控p53還是各自獨立對p53行使調控功能。有文獻報道,人類MDMX第463位半胱氨酸(MDMXC463)為MDM2形成二聚體所必需。為了揭示MDM2和MDMX對p53的調控模式,我們構建了Mdmx/C462A基因敲入小鼠模型。研究發(fā)現(xiàn)MdmxC462a/C462A純合子出現(xiàn)胚胎死亡現(xiàn)象;進一步分析發(fā)現(xiàn)M

3、dmxC462A/C462A純合子小鼠胚胎發(fā)育停止于9.5天左右;TLTNEL染色和BrdU摻入研究提示胚胎致死的主要原因是細胞凋亡的增多和增殖的減少。深入分析發(fā)現(xiàn)MdmxC462A/C462A純合子小鼠胚胎細胞中p53蛋白的表達水平和活性明顯增加,提示p53活性過高導致胚胎致死。為進一步證實該假設我們將MdmxWT/C462A雜合子與p53-/-小鼠交配得到MdmxWT/C462Ap53+/-雙雜合子小鼠,用該基因型雌鼠與雄鼠交配并觀

4、察后代基因型,結果發(fā)現(xiàn)p53基因敲除小鼠可以完全拯救MdmxC462a/C462A純合子小鼠胚胎致死的表型,證明了MdmxC462a/C462a胚胎致死依賴于p53的作用。
　　總之,我們的研究表明Mdmx/C462A突變后阻止了MDM2和MDMX形成異源二聚體,使p53的水平和活性得到了明顯提高,從而導致小鼠胚胎死亡,提示MDM2和MDMX異源二聚體復合物的形成是調控p53的必要步驟。
　　第二部分MUC1在食管癌轉移中的

5、作用和機制研究
　　食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一,高發(fā)的組織侵襲和腫瘤轉移是導致食管癌患者死亡的主要原因。研究表明MUC1和MMP13在食管癌病人中存在高表達,但二者的相關性未見報道。我們對40例食管癌病人組織和20例癌旁組織標本進行了免疫組化染色,結果發(fā)現(xiàn)MUC1蛋白在食管癌病人中顯著高表達。更重要的是,在淋巴結轉移的病人中MUC1和MMP13都表達增強且有很強的相關性。利用穩(wěn)轉細胞株研究表明MUC1過度表達可以上調MMP1

6、3的mRNA表達水平,同時增強細胞的移行能力。進一步通過對MMP13的啟動子分析發(fā)現(xiàn),啟動子中RUNX2結合位點突變后,MUC1對MMP13的表達調控作用喪失,提示MUC1可能通過RUNX2結合位點來促進MMP13的表達。利用食管癌MUC1基因沉默細胞系的研究發(fā)現(xiàn),當MUC1表達沉默后MMP13的表達水平隨之降低,細胞移行能力也明顯下降。如果將MMP13在MUC1基因沉默細胞系中過度高表達可以恢復細胞的粘附、聚集、移行和侵襲能力,表明M

7、UC1通過上調MMP13導致食管癌轉移的發(fā)生。以上結果提示MUC1可以作為新的食管癌診斷標記物和治療靶點。
　　第三部分 MUC1在肺癌發(fā)生和治療中的作用及機制研究
　　肺癌由于不易早期發(fā)現(xiàn)、治療方法有限,已成為死亡率最高的惡性腫瘤之一。肺癌主要分為小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)兩大類,NSCLC又可分為鱗

8、癌、腺癌和大細胞癌等不同類型。MUC1屬于單次跨膜的高分子量糖蛋白,在70％的實體瘤組織細胞中(包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌等)高表達并失去正常極性。為了研究MUC1在肺癌發(fā)生中的作用,我們對不同類型肺癌細胞株MUC1的表達進行了檢測,結果發(fā)現(xiàn)不同病理類型的肺癌細胞當中,MUC1的表達水平有所不同。我們選擇MUC1陰性的NCI-H460細胞株構建了MUC1穩(wěn)定過表達細胞系;同時選擇MUC1陽性的NCI-H446細胞株構建了MUC1基因穩(wěn)定

9、沉默細胞系。通過對兩組細胞的功能研究發(fā)現(xiàn)NCI-H460細胞株過表達MUC1可以增強細胞錨定非依賴生長的能力和裸鼠體內的成瘤性,同時也可以提高細胞移行和侵襲的能力。而NCI-H446細胞株基因沉默MUC1后以上能力均顯著下降。提示MUC1的高表達可以增強肺癌細胞株的致瘤性和轉移能力。
　　另外,我們研究發(fā)現(xiàn)NCI-H446 MUC1基因沉默細胞株由于MUC1表達下調導致了該細胞株對紫杉醇作用的敏感性增加,流式分析結果表明MUC1基

10、因沉默后細胞G2/M期阻滯明顯增多,同時細胞凋亡增加。進一步研究提示MUC1可能降低紫杉醇處理后BubR1的磷酸化水平,降低CyclinB1的蛋白水平,從而使細胞逃過紫杉醇導致的細胞周期阻滯。對MUC1在肺癌發(fā)生和藥物耐受作用機制的深入研究將為肺癌的治療及預后提供重要的理論意義及應用價值。
　　第四部分 AU021092條件性基因敲除小鼠模型的構建
　　隨著人類和小鼠基因組測序完成,對于大量未知基因的功能研究已成為當前研究的

11、熱點。利用基因敲除技術從整體動物水平研究基因功能、人類疾病發(fā)病機制和新藥作用靶點已成為現(xiàn)代生物學領域最常用的技術手段之一。小鼠AU021092基因定位于小鼠基因組16號染色體,基因全長10478 bp,僅有唯一轉錄本,由8個外顯子組成,轉錄產物為1375 bp,蛋白編碼產物為385個氨基酸。生物信息學分析該基因進化上高度保守,與人的同源性達71％。蛋白結構分析預測AU021092為分泌蛋白,其N端存在20個氨基酸信號肽序列,C端存在4個