鄰位開環(huán)雙加氧酶TcID1介導(dǎo)朱砂葉螨對兩種殺螨劑抗性研究.pdf

1、朱砂葉螨(Tetranychus cinnabarinus)在我國分布廣泛，主要危害棉花、蔬菜等農(nóng)作物。目前我國對于農(nóng)業(yè)害螨的防治主要以化學(xué)防治為主，其中阿維菌素和甲氰菊酯是使用十分廣泛的殺螨劑。這些殺螨劑的大量使用以及葉螨自身的生理特性，導(dǎo)致我國絕大多數(shù)地區(qū)的朱砂葉螨已經(jīng)對阿維菌素和甲氰菊酯產(chǎn)生了抗藥性。
　　鄰位開環(huán)雙加氧酶（Introdial ring-cleavage dioxygenases，ID-RCDs）是一類能夠催

2、化鄰苯二酚類底物氧化分解的雙加氧酶，主要存在于微生物如真菌、細菌中，其主要功能是降解帶有芳香環(huán)的化合物。朱砂葉螨的基因芯片檢測結(jié)果顯示，相對于敏感品系（Susceptible strain，SS），ID-RCDs基因在阿維菌素抗性品系（Abametin resistant strain，AbR）和甲氰菊酯抗性品系（Fenpropathrinreisitant strain，F(xiàn)eR）中均上調(diào)表達。因此，本論文在此基礎(chǔ)上，重點研究了ID-R

3、CDs與朱砂葉螨對阿維菌素和甲氰菊酯抗性的關(guān)系并取得了以下研究結(jié)果：
　　1、朱砂葉螨ID-RCDs酶活性測定。
　　對朱砂葉螨ID-RCDs酶進行粗酶活性測定，該酶在AbR及FeR中的活性均顯著高于SS品系，其中AbR品系酶活性是SS品系的1.63倍，F(xiàn)eR品系酶活性是SS品系的2.0倍。
　　2、朱砂葉螨TcID1基因克隆及序列分析。
　　基因克隆結(jié)果顯示，朱砂葉螨TcID1基因全長的開放閱讀框長度為774b

4、p，編碼257個氨基酸，蛋白分子量為29.4kD，等電點為5.31。經(jīng)Signal IP4.1在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)TcID1的翻譯氨基酸含有23個氨基酸的信號肽，可能屬于分泌蛋白。對朱砂葉螨TcID1氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)TcID1編碼的蛋白具有鄰位開環(huán)雙加氧酶特有的Fe3+結(jié)合位點：2個His和2個Tyr。與二斑葉螨、細菌、真菌等同源基因進行氨基酸序列相似性和進化分析，結(jié)果顯示：朱砂葉螨TcID1基因與二斑葉螨基因tetur06g00460

5、的相似度最高，氨基酸一致性為98％；與伊氏葉螨AFY99039.1氨基酸一致性為66%；而與真菌或細菌ID-RCDs相關(guān)的氨基酸一致性均低于40%。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，相對于細菌，朱砂葉螨TcID1基因與真菌類ID-RCDs具有更高的同源性。
　　3、TcID1基因在不同螨態(tài)、不同品系、藥劑脅迫下的mRNA表達模式。
　　qPCR結(jié)果顯示：在朱砂葉螨敏感品系的不同螨態(tài)中，TcID1基因在幼螨、若螨及3日齡雌成螨中均呈高表達，

6、并且在若螨中表達量最高，其次為幼螨、成螨、卵；在不同品系之間，相對于敏感品系，AbR及FeR品系均呈高表達，這也驗證了基因芯片中的相關(guān)結(jié)果；在阿維菌素（藥劑在各品系中的LC30劑量）脅迫6h、12h及24h后，TcID1基因在SS品系表現(xiàn)為先增加后降低的表達模式；在AbR品系表現(xiàn)為先降低后增加的表達模式；甲氰菊酯脅迫6h、12h及24h后，TcID1基因的表達模式同阿維菌素脅迫結(jié)果類似。
　　4、RNAi鑒定TcID1基因在朱砂葉

7、螨對殺螨劑抗性的功能。
　　采用葉碟法間接飼喂TcID1-dsRNA后，SS品系TcID1基因表達量下降60.7%，ID-RCDs酶活性降低38%，對阿維菌素的敏感性顯著增加，表現(xiàn)為死亡率顯著升高，分別為44%（阿維菌素LC30處理）和38%（阿維菌素LC50處理）；而對甲氰菊酯的敏感性無顯著變化；飼喂TcID1-dsRNA后，AbR品系TcID1基因表達量下降67.5%，ID-RCDs酶活性降低44%，對阿維菌素的敏感性顯著增加

8、，表現(xiàn)為死亡率顯著升高，分別為19.5%（阿維菌素LC30處理）和17%（阿維菌素LC50處理）；飼喂TcID1-dsRNA后，F(xiàn)eR品系 TcID1基因表達量下降47.7%，ID-RCDs酶活性降低40%，而對甲氰菊酯的敏感性無顯著變化。
　　5、原核表達TcID1基因。
　　以pColdⅡ為表達載體，構(gòu)建去除信號肽的TcID1重組表達質(zhì)粒，并測序驗證。將測序正確的重組質(zhì)粒TcID1-pColdⅡ轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中

9、，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)該基因一部分以可溶性表達，一部分以包涵體形式表達；經(jīng)過鎳親和層析柱純化，Western Blot檢測表明TcID1基因在大腸桿菌中成功表達。以原兒茶酸為底物進行蛋白活性測定，結(jié)果顯示重組蛋白比活力為0.1346±0.0090 nmol/μg.pro/min，Km為14.2±4.6 mM，Vmax為0.1163±0.0153 nmol/μg.pro/min。
　　6、TcID1異源表