漆酶GhLac1介導(dǎo)棉花廣譜抗性的機(jī)制解析.pdf

1、生長在自然環(huán)境中的植物，無時不刻都在遭受著病原菌和植食性昆蟲的侵害。在長期的共進(jìn)化和互相選擇的過程中，植物建立起了一個復(fù)雜而精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)去感知和響應(yīng)不同的生物脅迫類型，并迅速的激活植物體內(nèi)相應(yīng)的應(yīng)答路徑，在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平和代謝水平上建立起新的生理生化平衡。在大田環(huán)境中，多種病蟲害并存，提高植物的廣譜抗性能力才能適應(yīng)復(fù)雜多變的自然環(huán)境。本研究從棉花原生質(zhì)體細(xì)胞壁重建的抑制消減雜交文庫中克隆了一個能夠促進(jìn)細(xì)胞壁合成的基因GhLac1，

2、并對其在介導(dǎo)棉花廣譜抗性中的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，取得的主要結(jié)果如下:
　　1.鑒定到受多種處理誘導(dǎo)的漆酶基因GhLac1。
　　通過對陸地棉品系YZ1原生質(zhì)體細(xì)胞壁重建的抑制消減雜交文庫進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了3條與GaLAC1（Gossypium arboretum secretory laccase，GI:40218370）具有較高同源性的EST(expressed sequence tag)序列(GI:213047554，GI

3、:213047555和GI:213047556)。對這3條EST序列進(jìn)行表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)GI:213047556受黃萎病菌、茉莉酸和H2O2誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)最為顯著。因此，我們克隆了陸地棉GI:213047556的全長并命名為GhLac1。GhLac1編碼一個含有566個氨基酸的蛋白，且含有植物漆酶典型的銅離子結(jié)合位點，以及N端分泌蛋白信號肽。進(jìn)化分析表明，GhLac1與來源于可可的漆酶TvLac(GI:590604253)相似性最高。組

4、織表達(dá)模式表明GhLac1在根系中表達(dá)量最高，其次是葉片。
　　2.超量表達(dá)GhLac1能夠促進(jìn)木質(zhì)素合成并增強棉花的廣譜抗性。
　　為了驗證GhLac1在棉花中的功能，我們構(gòu)建了煙草花葉病毒35S啟動子驅(qū)動的GhLac1超量表達(dá)(35S∷GhLac1)和RNAi抑制表達(dá)(35S∷RNAi GhLac1)載體，并獲得了相應(yīng)的超量表達(dá)株系(OL-12、OL-13和OL-56)和RNAi抑制表達(dá)株系（iL-1和iL-11）。后續(xù)

5、研究發(fā)現(xiàn)，GhLac1超量表達(dá)材料中木質(zhì)素含量增加，這與已報道的植物漆酶能夠促進(jìn)木質(zhì)素單體聚合的功能相吻合?？剐澡b定表明，超量表達(dá)GhLac1提高了轉(zhuǎn)基因棉花對黃萎病菌、棉鈴蟲和棉蚜的抗性。
　　3.抑制GhLac1表達(dá)能夠促進(jìn)棉花黃酮類次生代謝物及茉莉酸合成并增強轉(zhuǎn)基因材料對黃萎病菌和棉鈴蟲的抗性。
　　在抑制GhLac1表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因材料的木質(zhì)素含量減少，但是苯丙烷代謝路徑上游基因的表達(dá)水平和蛋白酶活明顯增加。后續(xù)實驗也

6、證實了，在GhLac1抑制表達(dá)材料中總黃酮的含量增加，并具有抑制黃萎病菌和棉鈴蟲生長的作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)在GhLac1抑制表達(dá)材料中，茉莉酸和茉莉酸異亮氨酸含量增加，茉莉酸介導(dǎo)的信號路徑組成性激活。因此，抑制GhLac1表達(dá)增強棉花對黃萎病菌和棉鈴蟲抗性增強可能與黃酮等次生代謝物的積累和茉莉酸信號路徑的組成性激活有關(guān)。
　　4.抑制GhLac1表達(dá)導(dǎo)致棉花對棉蚜的敏感性。
　　對GhLac1抑制表達(dá)材料進(jìn)行蚜蟲接種鑒定，

7、結(jié)果表明，與對照材料相比，轉(zhuǎn)基因材料更感蚜蟲。這可能是由于抑制GhLac1表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因材料中木質(zhì)素含量減少，有利于蚜蟲口器的刺入，方便蚜蟲的取食;此外，在GhLac1抑制表達(dá)材料中，由于茉莉酸信號路徑組成性激活間接抑制了在抗蚜蟲中具有重要作用的水楊酸信號路徑，因而導(dǎo)致GhLac1抑制表達(dá)材料更感蚜蟲。
　　5.GhLac1抑制表達(dá)材料中茉莉酸含量增加依賴于細(xì)胞壁多糖含量的增加。
　　病原菌入侵或植食性昆蟲取食造傷的細(xì)胞壁損

8、傷，會造成胞壁區(qū)間內(nèi)細(xì)胞壁多糖含量的增加，而位于細(xì)胞膜上的相關(guān)受體能夠識別這種多糖信號并激活植物免疫系統(tǒng)。細(xì)胞壁多糖含量測定表明，與對照材料相比，GhLac1抑制表達(dá)材料中水溶性和EDTA溶解性細(xì)胞壁多糖含量最高，而GhLac1超量表達(dá)材料中含量最低。用轉(zhuǎn)基因材料和對照材料的水溶性細(xì)胞壁多糖處理棉花懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系，也證實了這種水溶性多糖能夠促進(jìn)茉莉酸的合成，且茉莉酸的含量和處理時所用水溶性多糖含量正相關(guān)。因此，我們推測GhLac1抑制表