漆酶GhLac1介導(dǎo)棉花廣譜抗性的機(jī)制解析.pdf

1、生長(zhǎng)在自然環(huán)境中的植物，無(wú)時(shí)不刻都在遭受著病原菌和植食性昆蟲(chóng)的侵害。在長(zhǎng)期的共進(jìn)化和互相選擇的過(guò)程中，植物建立起了一個(gè)復(fù)雜而精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)去感知和響應(yīng)不同的生物脅迫類(lèi)型，并迅速的激活植物體內(nèi)相應(yīng)的應(yīng)答路徑，在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平和代謝水平上建立起新的生理生化平衡。在大田環(huán)境中，多種病蟲(chóng)害并存，提高植物的廣譜抗性能力才能適應(yīng)復(fù)雜多變的自然環(huán)境。本研究從棉花原生質(zhì)體細(xì)胞壁重建的抑制消減雜交文庫(kù)中克隆了一個(gè)能夠促進(jìn)細(xì)胞壁合成的基因GhLac1，

2、并對(duì)其在介導(dǎo)棉花廣譜抗性中的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，取得的主要結(jié)果如下:
　　1.鑒定到受多種處理誘導(dǎo)的漆酶基因GhLac1。
　　通過(guò)對(duì)陸地棉品系YZ1原生質(zhì)體細(xì)胞壁重建的抑制消減雜交文庫(kù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了3條與GaLAC1（Gossypium arboretum secretory laccase，GI:40218370）具有較高同源性的EST(expressed sequence tag)序列(GI:213047554，GI

3、:213047555和GI:213047556)。對(duì)這3條EST序列進(jìn)行表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)GI:213047556受黃萎病菌、茉莉酸和H2O2誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)最為顯著。因此，我們克隆了陸地棉GI:213047556的全長(zhǎng)并命名為GhLac1。GhLac1編碼一個(gè)含有566個(gè)氨基酸的蛋白，且含有植物漆酶典型的銅離子結(jié)合位點(diǎn)，以及N端分泌蛋白信號(hào)肽。進(jìn)化分析表明，GhLac1與來(lái)源于可可的漆酶TvLac(GI:590604253)相似性最高。組

4、織表達(dá)模式表明GhLac1在根系中表達(dá)量最高，其次是葉片。
　　2.超量表達(dá)GhLac1能夠促進(jìn)木質(zhì)素合成并增強(qiáng)棉花的廣譜抗性。
　　為了驗(yàn)證GhLac1在棉花中的功能，我們構(gòu)建了煙草花葉病毒35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GhLac1超量表達(dá)(35S∷GhLac1)和RNAi抑制表達(dá)(35S∷RNAi GhLac1)載體，并獲得了相應(yīng)的超量表達(dá)株系(OL-12、OL-13和OL-56)和RNAi抑制表達(dá)株系（iL-1和iL-11）。后續(xù)

5、研究發(fā)現(xiàn)，GhLac1超量表達(dá)材料中木質(zhì)素含量增加，這與已報(bào)道的植物漆酶能夠促進(jìn)木質(zhì)素單體聚合的功能相吻合?？剐澡b定表明，超量表達(dá)GhLac1提高了轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)黃萎病菌、棉鈴蟲(chóng)和棉蚜的抗性。
　　3.抑制GhLac1表達(dá)能夠促進(jìn)棉花黃酮類(lèi)次生代謝物及茉莉酸合成并增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因材料對(duì)黃萎病菌和棉鈴蟲(chóng)的抗性。
　　在抑制GhLac1表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因材料的木質(zhì)素含量減少，但是苯丙烷代謝路徑上游基因的表達(dá)水平和蛋白酶活明顯增加。后續(xù)實(shí)驗(yàn)也

6、證實(shí)了，在GhLac1抑制表達(dá)材料中總黃酮的含量增加，并具有抑制黃萎病菌和棉鈴蟲(chóng)生長(zhǎng)的作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)在GhLac1抑制表達(dá)材料中，茉莉酸和茉莉酸異亮氨酸含量增加，茉莉酸介導(dǎo)的信號(hào)路徑組成性激活。因此，抑制GhLac1表達(dá)增強(qiáng)棉花對(duì)黃萎病菌和棉鈴蟲(chóng)抗性增強(qiáng)可能與黃酮等次生代謝物的積累和茉莉酸信號(hào)路徑的組成性激活有關(guān)。
　　4.抑制GhLac1表達(dá)導(dǎo)致棉花對(duì)棉蚜的敏感性。
　　對(duì)GhLac1抑制表達(dá)材料進(jìn)行蚜蟲(chóng)接種鑒定，

7、結(jié)果表明，與對(duì)照材料相比，轉(zhuǎn)基因材料更感蚜蟲(chóng)。這可能是由于抑制GhLac1表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因材料中木質(zhì)素含量減少，有利于蚜蟲(chóng)口器的刺入，方便蚜蟲(chóng)的取食;此外，在GhLac1抑制表達(dá)材料中，由于茉莉酸信號(hào)路徑組成性激活間接抑制了在抗蚜蟲(chóng)中具有重要作用的水楊酸信號(hào)路徑，因而導(dǎo)致GhLac1抑制表達(dá)材料更感蚜蟲(chóng)。
　　5.GhLac1抑制表達(dá)材料中茉莉酸含量增加依賴(lài)于細(xì)胞壁多糖含量的增加。
　　病原菌入侵或植食性昆蟲(chóng)取食造傷的細(xì)胞壁損

8、傷，會(huì)造成胞壁區(qū)間內(nèi)細(xì)胞壁多糖含量的增加，而位于細(xì)胞膜上的相關(guān)受體能夠識(shí)別這種多糖信號(hào)并激活植物免疫系統(tǒng)。細(xì)胞壁多糖含量測(cè)定表明，與對(duì)照材料相比，GhLac1抑制表達(dá)材料中水溶性和EDTA溶解性細(xì)胞壁多糖含量最高，而GhLac1超量表達(dá)材料中含量最低。用轉(zhuǎn)基因材料和對(duì)照材料的水溶性細(xì)胞壁多糖處理棉花懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系，也證實(shí)了這種水溶性多糖能夠促進(jìn)茉莉酸的合成，且茉莉酸的含量和處理時(shí)所用水溶性多糖含量正相關(guān)。因此，我們推測(cè)GhLac1抑制表