凝血酶-海藻酸鈣復(fù)合微球介入栓塞止血?jiǎng)┑难兄萍皯?yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、目前，國(guó)內(nèi)外常用的血管介入栓塞止血?jiǎng)┲饕形椈扇Α⒚髂z海綿等固體材料以及氰基丙烯酸鹽粘合劑、Onyx等液體材料。微彈簧圈為永久性栓塞劑，制作材料為銅、鎢、鉑等貴金屬，種類繁多，制造工藝復(fù)雜且價(jià)格昂貴，使用時(shí)需根據(jù)靶血管管徑選擇相應(yīng)型號(hào)。此外，微彈簧圈作為栓塞材料還存在栓塞不完全、血栓形成率低等不足，且永久性栓塞可導(dǎo)致臟器功能組織體積萎縮或引起慢性炎癥甚至是器官損傷。明膠海綿是一種由多種氨基酸組成的動(dòng)物蛋白，能被人體組織吸收，具有使用方

2、便、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，最先被應(yīng)用于外科手術(shù)的術(shù)中止血。在介入領(lǐng)域，明膠海綿顆粒是目前唯一獲批用于體內(nèi)的生物可降解栓塞材料，主要用于破損血管的臨時(shí)止血或腫瘤切除術(shù)前的臨時(shí)血流阻斷。明膠海綿顆粒在體內(nèi)的降解吸收受諸多因素的影響，降解時(shí)間可從數(shù)日到數(shù)月不等，可在完全止血前即被機(jī)體吸收，使受損動(dòng)脈發(fā)生再出血的幾率增加。
　　因此，針對(duì)脾臟等腹腔實(shí)質(zhì)臟器損傷出血的微創(chuàng)介入治療目前尚無(wú)十分理想的栓塞材料。
　　采用海藻酸鈉等天然高分子生物

3、材料裝載具有治療作用的藥物以制備載藥微球栓塞劑，是近年來(lái)介入栓塞材料研究的熱點(diǎn)之一。其中以海藻酸鈉為原料制備的微球栓塞劑可裝載和靶向釋放藥物，具有安全無(wú)毒、降解可控、普適性強(qiáng)、方便易用的優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥研究領(lǐng)域。高效止血藥物凝血酶是一種針對(duì)外傷出血或消化道出血的常用止血?jiǎng)?，可促進(jìn)血液中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，迅速形成血栓，適用于不同出血部位，特別是用于不規(guī)則傷口或創(chuàng)面的快速止血。但在凝血酶作用下由血液成分所形成的自體血栓

4、質(zhì)地軟、強(qiáng)度差，易脫落或過(guò)早自溶，止血效果不穩(wěn)定。根據(jù)上述情況，本課題擬將天然高分子生物材料海藻酸鈉與高效止血藥物凝血酶結(jié)合，制備新型復(fù)合微球介入栓塞止血?jiǎng)?，并?duì)其物理學(xué)、藥劑學(xué)和生物學(xué)特性進(jìn)行研究，之后通過(guò)脾臟損傷出血?jiǎng)游锬Ｐ?，探索該新型栓塞材料的最佳使用方式并考察評(píng)估其栓塞止血效果。通過(guò)本課題，擬為脾臟等腹腔實(shí)質(zhì)器官損傷出血的介入治療提供高效、安全、普適、便捷且具有良好生物相容性的新型栓塞材料。
　　主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:<

5、br>　　1、凝血酶-海藻酸鈣復(fù)合微球介入栓塞止血?jiǎng)┑难兄?br>　　根據(jù)海藻酸鈉的理化性質(zhì)，以及蛋白質(zhì)活性藥物凝血酶的藥理特性，選擇反應(yīng)條件溫和的靜電液滴法成功制備出凝血酶-海藻酸鈣復(fù)合微球。在本研究中，制備凝血酶-海藻酸鈣復(fù)合載藥微球的原料液為由生理鹽水(NS)配制的10mg/ml凝血酶-3％w/v海藻酸鈉混合溶液，凝膠浴溶液為30g/L CaCl2、5g/L NaCl、1g/L NaH2P04和5g/L吐溫-20組成的混合液。在高

6、壓靜電成球裝置(YD-06)的靜電場(chǎng)力和自身重力作用下，原料液形成的細(xì)小液滴克服針尖粘附力和液體表面張力，快速滴入凝膠浴溶液中，通過(guò)海藻酸分子結(jié)構(gòu)中的羧基與凝膠浴溶液中的Ca2+發(fā)生聚電解質(zhì)反應(yīng)，快速形成載有凝血酶的海藻酸鈣微球。最終通過(guò)設(shè)置不同的設(shè)備參數(shù)，制備出了350μm和600μm兩種粒徑的載藥微球產(chǎn)品。試制實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，載藥微球的粒徑與靜電場(chǎng)電壓呈正相關(guān)，與針孔直徑、針頭與凝固液面距離、原料液流呈速負(fù)相關(guān)。光鏡和掃描電鏡結(jié)果

7、顯示，所制備的凝血酶-海藻酸鈣微球粒徑均勻，凝血酶在球體內(nèi)部和表面散在分布，微球結(jié)構(gòu)疏松，表面粗糙并有大量微孔。上述結(jié)構(gòu)特征將有利于微球與血液接觸后快速釋放表層凝血酶，同時(shí)粗糙多孔的微球表面將有利于網(wǎng)羅血液中的血小板和紅細(xì)胞，激活凝血，快速形成含有微球的堅(jiān)實(shí)血栓。
　　2、凝血酶-海藻酸鈣復(fù)合微球介入栓塞止血?jiǎng)┑乃巹W(xué)和物理學(xué)特性研究
　　(1)載藥量與包封率
　　將所制備的凝血酶-海藻酸鈣復(fù)合微球溶解于EDTA，利用

8、紫外分光光度法檢測(cè)溶液中凝血酶的濃度，并計(jì)算出微球的包封率（entrapment efficiency，EE）和載藥量(drugloading，DL)。結(jié)果顯示，350μm微球的EE和DL分別為72.4±8.6％和20±4.1mg/ml，600μm微球的EE和DL分別為70.5±6.1％和13±5.2mg/ml。兩種不同粒徑載藥微球的包封率均達(dá)70％以上且無(wú)顯著差異(p＞0.05)。由于350μm微球的粒徑更小，在相同單位體積內(nèi)，微球所

9、占據(jù)的有效體積大于后者600μm微球，因此350μm微球的載藥量高于600μm微球(p＜0.05)。
　　(2)釋藥模式與凝血酶活性殘余
　　以NS作為釋藥介質(zhì)，將定量微球投入其中并置于100rpm搖床上，環(huán)境溫度4℃。按預(yù)設(shè)的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，再利用紫外分光光度法檢測(cè)各樣品溶液中的凝血酶濃度，繪制釋藥曲線并對(duì)載藥微球的釋藥模式進(jìn)行擬合。結(jié)果顯示，0h-2h期間350μm微球中的凝血酶為快速釋藥相，累計(jì)釋藥率為34.4±4.9

10、％，此后為緩慢釋放相，192h的平均累計(jì)釋藥百分比可達(dá)90.23％;600μm微球則以緩釋為主，192h的平均累計(jì)釋藥率為67.07％。350μm載藥微球具有突釋和緩釋兩種釋藥模式，其累積釋藥率也明顯高于600μm載藥微球。突釋效應(yīng)對(duì)于微球與血液成分接觸后快速形成的混合血栓具有重要作用，緩釋則能夠持續(xù)保持靶點(diǎn)部位所需的藥物濃度。因此，350μm凝血酶-海藻酸鈣微球更加符合應(yīng)用需求。
　　本部分藥劑學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用靜電液滴法制備

11、凝血酶-海藻酸鈣微球具有藥物利用率高、釋藥模式理想、藥物活性好等特性，有望實(shí)現(xiàn)在體外與血液快速形成微球混合血栓和血管內(nèi)栓塞后不斷釋藥以加固血栓的既定目標(biāo)。物理學(xué)特性測(cè)試結(jié)果提示，凝血酶-海藻酸鈣微球作為一種新型材料，與血液混合所形成的混合血栓在強(qiáng)度和抗擠壓能力等方面均顯著強(qiáng)于柔軟易碎的單純血栓。因此，凝血酶-海藻酸鈣微球的藥劑學(xué)特性以及微球所參與形成混合血栓的物理學(xué)性質(zhì)均能滿足有效栓塞受損靶血管的應(yīng)用需求。
　　3、凝血酶-海藻酸

12、鈣復(fù)合微球介入栓塞止血?jiǎng)┑纳锵嗳菪匝芯?br>　　(1)體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
　　根據(jù)材料細(xì)胞毒性檢測(cè)的要求并結(jié)合凝血酶-海藻酸鈣微球材料的臨床應(yīng)用特點(diǎn)，選擇了小鼠成纖維細(xì)胞(L929)、人動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(VECs)和人外周血紅細(xì)胞(RBC)進(jìn)行了間接接觸（浸提液）和直接接觸兩種方式的細(xì)胞毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。L929細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，凝血酶-海藻酸鈣微球?yàn)榧?xì)胞毒性Ⅰ級(jí)（低細(xì)胞毒性）。
　　凝血酶-海藻酸鈣微球作為一種栓塞止血材

13、料，實(shí)際應(yīng)用時(shí)將與人動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞、紅細(xì)胞等直接發(fā)生接觸。VECs直接接觸毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，凝血酶-海藻酸鈣微球與VECs共培養(yǎng)后，細(xì)胞存活率與正常培養(yǎng)基對(duì)照組無(wú)明顯差異，表明無(wú)VECs細(xì)胞毒性;RBC溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，凝血酶-海藻酸鈣微球不引起外周血RBC發(fā)生溶血。
　　上述結(jié)果證實(shí)，凝血酶-海藻酸鈣微球作為一種血管內(nèi)應(yīng)用的新型栓塞材料，具有良好的細(xì)胞相容性和血液相容性。
　　(2)動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)
　　對(duì)于新型醫(yī)用材

14、料的最終臨床前評(píng)估，主要是基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。為此，我們利用C57BL/6J小鼠、SD大鼠、新西蘭兔等多種動(dòng)物模型，分別從潛在刺激性、全身急性毒性、遺傳毒性、組織炎癥反應(yīng)以及體內(nèi)降解速率等方面對(duì)凝血酶-海藻酸鈣微球的組織相容性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)評(píng)估。
　　新西蘭大白兔的背部皮膚具有高度敏感性，是皮內(nèi)注射刺激試驗(yàn)的理想動(dòng)物模型。在本研究中，將含高濃度凝血酶-海藻酸鈣微球溶出物的浸提液1ml分別注射到4只雄性新西蘭大白兔背部皮內(nèi)后，在72h的觀察期

15、內(nèi)未見(jiàn)局部皮膚發(fā)生任何紅斑、紅疹、水皰或水腫等異常反應(yīng)，刺激評(píng)分為0分，與NS對(duì)照組無(wú)差異。因此，凝血酶-海藻酸鈣微球?qū)C(jī)體組織無(wú)潛在刺激性和毒性。
　　將40只雄性C57小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組（每組各20只），實(shí)驗(yàn)組于腹腔內(nèi)注入高濃度凝血酶-海藻酸鈣微球浸提液1ml，對(duì)照組則用NS代替，以觀察微球溶出物是否引起的全身急性毒性反應(yīng)。為期28d的觀察結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和NS對(duì)照組動(dòng)物的一般情況均正常，未發(fā)現(xiàn)死亡或異常行為活動(dòng)，兩組

16、動(dòng)物腹腔注射后的體重增長(zhǎng)量無(wú)差異;組織學(xué)檢查結(jié)果示實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的心臟、肝臟、脾臟、肺及腎臟等主要臟器無(wú)明顯病理改變。凝血酶-海藻酸鈣微球的遺傳毒性檢測(cè)采用的是骨髓微核實(shí)驗(yàn)。將15只雄性C57小鼠隨機(jī)分為凝血酶-海藻酸鈣微球浸提液實(shí)驗(yàn)組，環(huán)磷酰胺注射液陽(yáng)性對(duì)照組和NS陰性對(duì)照組，分別按照50ml/kg，40mg/kg和50ml/kg的劑量行腹腔內(nèi)注射，24h后取股骨骨髓涂片并行組織學(xué)檢查。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)腹腔注射浸提液后，C57小鼠骨髓中的

17、微核形成率與陰性對(duì)照(NS)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而環(huán)磷酰胺注射液陽(yáng)性對(duì)照組的微核形成率明顯高于實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組。因此，凝血酶-海藻酸鈣微球既不引起全身急性毒性反應(yīng)，又無(wú)導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞DNA斷裂和非整倍體化的遺傳毒性。
　　綜上所述，本部分體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，凝血酶-海藻酸鈣載藥微球是一種具有良好的細(xì)胞相容性、血液相容性和組織相容性的可降解材料，符合對(duì)栓塞材料的生物安全性要求。
　　綜上所述，本課題針對(duì)腹腔實(shí)質(zhì)臟

18、器閉合性損傷尚無(wú)理想栓塞材料的現(xiàn)狀，成功探索了新型天然高分子生物復(fù)合栓塞止血材料凝血酶-海藻酸鈣微球的制備技術(shù)方法，并對(duì)其藥劑學(xué)和物理學(xué)特性，生物相容性，以及臨床適用性進(jìn)行了全面研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)了該新型材料具有栓塞止血迅速、效果可靠、普適性強(qiáng)、使用方便、生物相容性好等特征，適用于脾臟、腎臟等腹腔實(shí)質(zhì)臟器閉合性損傷的介入止血治療。該新型栓塞材料的研發(fā)和應(yīng)用將有助于進(jìn)一步提高實(shí)質(zhì)臟器損傷出血的介入救治效果，改善預(yù)后，同時(shí)也為天然生物高