蝦肝腸胞蟲(chóng)（ehp）檢測(cè) 套式pcr法（意見(jiàn)征求稿）編制說(shuō)明

1、浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)《蝦肝腸胞蟲(chóng)(EHP)檢測(cè)套式PCR 法》編制說(shuō)明一、項(xiàng)目背景蝦肝腸胞蟲(chóng)（Enterocytozoonhepatopenaei，EHP）又稱“腸胞蟲(chóng)”，屬于微孢子蟲(chóng)科，腸胞蟲(chóng)屬，是一種可感染多種真核生物的專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)， 2004年最早發(fā)現(xiàn)于泰國(guó)養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)，2009 年被正式命名報(bào)道。近年來(lái)先后在澳大利亞、中國(guó)、印度、越南、印度尼西亞、馬來(lái)西亞等亞太地區(qū)主要對(duì)蝦養(yǎng)殖國(guó)家發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重影響對(duì)

2、蝦正常生長(zhǎng)，已成為阻礙對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要病原。近幾年的中國(guó)水生動(dòng)物衛(wèi)生狀況報(bào)告顯示，我國(guó)沿海多省份養(yǎng)殖蝦類蝦肝腸胞蟲(chóng)病病原陽(yáng)性檢出率均高達(dá) 30% 以上。。浙江省南美白對(duì)蝦產(chǎn)量 113514 噸，已成為我省水產(chǎn)養(yǎng)殖的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一。省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站蝦已連續(xù)多年對(duì)南美白對(duì)蝦苗種疫病進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明：2015-2018 年 EHP 陽(yáng)性檢出率逐年上升，最高可達(dá) 47.1%。EHP 感染雖不會(huì)造成蝦類的大量死亡，但可引起生長(zhǎng)緩慢或停滯，

3、嚴(yán)重的甚至養(yǎng)殖 90 天以上的規(guī)格小于 4 克/尾，不得不采取排塘措施，經(jīng)濟(jì)損失慘重，嚴(yán)重影響了對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。2018 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已將 EHP 作為新發(fā)疫病納入國(guó)家水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)，并在其組織的水生動(dòng)物防疫系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力測(cè)試中增加該項(xiàng)測(cè)試。EHP 可通過(guò)水平和垂直傳播，包括經(jīng)口攝食傳播，或直接通過(guò)養(yǎng)殖水體在對(duì)蝦中進(jìn)行傳播，主要感染蝦的腸道表皮，進(jìn)而感染肝胰腺，引起對(duì)蝦腸道吸收功能下降，嚴(yán)重的出現(xiàn)腸炎和肝胰腺萎縮，導(dǎo)致蝦生長(zhǎng)出

4、現(xiàn)遲緩。但 EHP 感染無(wú)明顯的早期臨床癥狀，也并不導(dǎo)致對(duì)蝦死亡，感染 EHP 的蝦食欲表現(xiàn)正常，并不停止攝食，空耗飼料、水電和人工等，因而，EHP 早期感染不易被發(fā)現(xiàn)。此外由于 EHP 細(xì)胞內(nèi)寄生的特性，目前也未有能夠殺滅或者控制其發(fā)展的有效藥物，因此早期快速檢測(cè)技術(shù)的建立至關(guān)重要，從源頭防控該病原的感染。標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目公開(kāi)招標(biāo)，將《蝦肝腸胞蟲(chóng)(EHP)檢測(cè)套式 PCR 法》標(biāo)準(zhǔn)列入規(guī)劃。（二）標(biāo)準(zhǔn)制定協(xié)作單位本標(biāo)準(zhǔn)制訂工作由浙江省水

5、產(chǎn)技術(shù)推廣總站主持，浙江省休閑觀賞漁業(yè)行業(yè)協(xié)會(huì)、浙江省海水水產(chǎn)研究所、杭州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心等單位共同協(xié)作實(shí)施，成立了標(biāo)準(zhǔn)制訂小組，分工協(xié)作，開(kāi)展標(biāo)準(zhǔn)的起草、審查、征求意見(jiàn)及審定等工作。（三）主要起草人及其分工標(biāo)準(zhǔn)制定任務(wù)下達(dá)后，2019 年 8 月，組成了標(biāo)準(zhǔn)起草工作組，明確了任務(wù)要求，安排了工作進(jìn)度。起草小組標(biāo)準(zhǔn)起草人員構(gòu)成，見(jiàn)表 1。表 3 標(biāo)準(zhǔn)起草小組構(gòu)成表姓名 專業(yè) 職稱 主要任務(wù)朱凝瑜 預(yù)防獸醫(yī) 工程師 項(xiàng)目主持人鄭曉葉 漁

6、業(yè) 工程師 技術(shù)指標(biāo)確認(rèn)梁倩蓉 水生動(dòng)物醫(yī)學(xué) 助理工程師 試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理、分析周凡 水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料 高工 參與編制制定葉鍵 水產(chǎn)養(yǎng)殖 高工 方法驗(yàn)證許婷 水產(chǎn)養(yǎng)殖 講師 方法驗(yàn)證黃家慶 淡水漁業(yè) 高工 參與編制制定丁雪燕 水產(chǎn)養(yǎng)殖 研究員 項(xiàng)目指導(dǎo)吳洪喜 水產(chǎn)養(yǎng)殖 研究員 項(xiàng)目指導(dǎo)（四）編制工作情況標(biāo)準(zhǔn)起草單位在接到該標(biāo)準(zhǔn)制訂任務(wù)后，按要求成立了標(biāo)準(zhǔn)制訂小組，查閱相關(guān)的專著、期刊，對(duì)國(guó)際和國(guó)內(nèi)關(guān)于腸胞蟲(chóng)的檢測(cè)方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)論文等

7、資料進(jìn)行了調(diào)研，熟悉了目前已有的檢測(cè)方法及其優(yōu)缺點(diǎn)。2019 年~2020 年，選取近年來(lái)采集的具有典型代表的 21 個(gè)南美白對(duì)蝦樣本、6 個(gè)餌料樣本及 15 個(gè)水樣，在套式 PCR 基礎(chǔ)上增加了水樣處理方法，擴(kuò)大了檢測(cè)方法的使用范圍。同時(shí)根據(jù) swp 序列設(shè)計(jì)引物，建立 SYBR q-PCR 及 LAMP 檢測(cè)方法，提高了檢測(cè)靈敏度，縮短了檢測(cè)時(shí)間。2021 年 1-6 月又對(duì)兩種方法中的條件進(jìn)行了優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上，起草了省級(jí)地方標(biāo)準(zhǔn)