海洋生物膠原蛋白和靜電紡絲膜促進(jìn)傷口愈合作用研究.pdf

1、膠原蛋白具有優(yōu)良的物理機(jī)械性能、良好的生物相容性、安全性和低免疫原性，能促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖，促使血管形成、肉芽生長(zhǎng)和上皮化，加快傷口愈合的進(jìn)度，能作為優(yōu)良的生物材料。通過靜電紡絲技術(shù)制備膠原蛋白靜電紡絲膜，同時(shí)具備膠原蛋白優(yōu)良的生物學(xué)性能和靜電紡絲納米纖維高比表面積、高孔隙率、孔道連通性、三維結(jié)構(gòu)和仿生天然細(xì)胞外基質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，有望成為優(yōu)異的生物醫(yī)學(xué)組織工程材料。評(píng)價(jià)生物醫(yī)學(xué)組織工程材料的功效作用是開展臨床前研究的重點(diǎn)內(nèi)容，以膠原蛋白為主，

2、配合聚氧化乙烯（PEO）或殼聚糖，采用納米靜電紡絲技術(shù)，制備獲得膠原蛋白靜電紡絲膜，研究膠原蛋白靜電紡絲膜促進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠損傷皮膚愈合等功效作用，同時(shí)評(píng)價(jià)膠原蛋白的抑菌和止血作用。為膠原蛋白靜電紡絲膜作為生物敷料提供研究依據(jù)。
　　第一章介紹了膠原蛋白靜電紡絲膜研究進(jìn)展，包括膠原蛋白概況、靜電紡絲技術(shù)、膠原蛋白靜電紡絲膜優(yōu)點(diǎn)及研究現(xiàn)狀，臨床應(yīng)用以及創(chuàng)傷愈合等的內(nèi)容。
　　第二章研究膠原蛋白的抗菌性能。
　　以羅非魚皮膠

3、原蛋白和牛膠原蛋白(Bovine skin collagen, BSC)為原料，研究BSC、羅非魚皮酶溶性膠原蛋白(Pepsin soluble collagen fromTilapia skin, PSC)、羅非魚皮酸溶性膠原蛋白(Acid soluble collagenfrom Tilapia skin, ASC)的抗菌性能。羅非魚皮經(jīng)浸提、離心、透析和冷凍干燥等步驟獲得干燥的PSC、ASC。采用含有 BSC、PSC或 ASC的胰

4、蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌，定時(shí)測(cè)定細(xì)菌培養(yǎng)液的吸光度值、菌數(shù)、菌體細(xì)胞液電導(dǎo)率和細(xì)菌的形態(tài)特征。BSC、PSC、ASC對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌均有不同程度的生長(zhǎng)抑制作用，抑制率從22.97％±2.35%到65.21%±6.42%，其中 PSC抑制銅綠假單胞菌作用顯著，抑制率達(dá)到65.21%±6.42%；ASC抑制大腸桿菌作用微弱，抑制率只有22.97%±2

5、.35%。血球計(jì)數(shù)板法得到的抑菌效果類似吸光度值得到的結(jié)果，但是抑制率存在差別。PSC、ASC造成大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌的菌體細(xì)胞液電導(dǎo)率從36.42±1.35μs/cm變化到185.80±4.70μs/cm，其中PSC使銅綠假單胞菌的電導(dǎo)率低至36.42±1.35μs/cm，ASC使白色念珠菌的電導(dǎo)率達(dá)到185.80±4.70μs/cm。電鏡下觀察到抑菌率高和電導(dǎo)率低的菌株出現(xiàn)菌體變形和細(xì)胞壁破裂等現(xiàn)象。與

6、BSC相比，PSC、ASC從細(xì)菌抑制率、菌體細(xì)胞液電導(dǎo)率和細(xì)菌的形態(tài)特征體現(xiàn)出一定的抑菌特性。
　　第三章研究膠原蛋白及其靜電紡絲膜的促愈合性能。
　　以BSC為原料制備膠原蛋白靜電紡絲膜(electrospun bovine collagen nanofibers,EBCN）。膠原蛋白靜電紡絲參數(shù)為：靜電紡絲溶劑為六氟乙丙醇和乙酸的混合溶液，其體積比為50:50，靜電紡絲液濃度為4%，m（膠原）：m（聚氧化乙烯：PEO）為

7、90:10。紡絲參數(shù)電壓為12 kv，推注速度為1 ml/h，接受距離為20 cm。制備兩種EBCN，其中EBCNⅠ為m（膠原）：m（PEO）為90:10， EBCNⅡ?yàn)?m（膠原）：m（PEO）：m（殼聚糖）=150:17:2。交聯(lián)條件為紫外照射12 h。通過制作大鼠皮膚全皮層損傷模型進(jìn)行促進(jìn)傷口愈合的功效研究，以傷口的愈合率、愈合時(shí)間、總蛋白含量、羥脯氨酸含量、病理組織切片和免疫組化分析為指標(biāo)評(píng)價(jià)BSC、PSC、ASC和EBCNⅠ、

8、EBCNⅡ的促愈合作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PSC、ASC、EBCNⅠ、EBCNⅡ能夠較快的促進(jìn)傷口的愈合，縮短愈合時(shí)間，且傷口組織中蛋白質(zhì)和羥脯氨酸的含量明顯高于紗布組，并略高于 BSC和邦迪組。HE染色結(jié)果表明，PSC、ASC、EBCNⅠ、EBCNⅡ能夠較好的減少傷口中的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增值，加速膠原纖維形成和膠原沉積，促進(jìn)肉芽組織生成和再上皮化，從而加速皮膚傷口愈合。免疫組化染色表明 PSC、ASC、EBCNⅠ、EBCNⅡ通過在愈

9、合過程中上調(diào) EGF、FGF、 CD31的水平，從而提高SD大鼠皮膚傷口的愈合速度和愈合質(zhì)量。
　　第四章研究膠原蛋白及其靜電紡絲膜的止血性能。
　　為了探究 BSC、PSC、ASC、EBCNⅠ、EBCNⅡ的止血性能，以新西蘭大白兔為動(dòng)物模型，制造耳部靜脈、耳部動(dòng)脈、肝臟出血?jiǎng)?chuàng)面以及測(cè)定體外凝血指數(shù)，探究膠原蛋白靜電紡絲膜的止血效果。ASC、EBCNⅠ、EBCNⅡ組新西蘭兔耳靜脈的止血時(shí)間與紗布組比較，差異顯著，EBCNⅠ、

10、EBCNⅡ組能明顯減少出血量。BSC、PSC組與紗布組相比，無(wú)顯著性差異。EBCNⅠ、EBCNⅡ組新西蘭兔耳動(dòng)脈的止血時(shí)間與紗布組比較，差異顯著，能減少出血時(shí)間和出血量。在新西蘭兔肝臟止血研究中，PSC、EBCNⅠ、EBCNⅡ比紗布組明顯縮短止血時(shí)間，ASC、EBCNⅠ、EBCNⅡ能明顯減少出血量，其中EBCNⅠ、EBCNⅡ組效果最好。體外凝血指數(shù)測(cè)定結(jié)果表明EBCNⅠ、EBCNⅡ組凝血指數(shù)明顯低于紗布組，且具有顯著性差異。EBCNⅠ、