海洋膠原肽對(duì)傷口愈合的研究

1、海洋膠原肽對(duì)大鼠剖宮產(chǎn)術(shù)后傷口愈合的影響,,提綱,一、研究背景二、研究目的三、材料和方法四、結(jié)果五、討論六、結(jié)論七、致謝,一、研究背景,1.剖宮產(chǎn)的現(xiàn)狀2.剖宮產(chǎn)的并發(fā)癥3.傷口愈合不良的危害4.傷口愈合的過程5.治療現(xiàn)狀6.膠原蛋白7.海洋膠原肽(MCP),剖宮產(chǎn)的現(xiàn)狀,剖宮產(chǎn)的現(xiàn)狀,,,剖宮產(chǎn)的現(xiàn)狀,中國(guó) 20世紀(jì)90年代初城市剖宮產(chǎn)率達(dá)20%左右；自90年代中期開始快速攀升，90年代末國(guó)內(nèi)大城市醫(yī)院的剖

2、宮產(chǎn)率即已達(dá)到30%～40%；目前雖無全國(guó)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，但大多數(shù)城市醫(yī)院報(bào)道的剖宮產(chǎn)率約在40%～60%，高者甚至達(dá)60%～80%以上。,剖宮產(chǎn)的并發(fā)癥,近期：麻醉意外、術(shù)后出血、產(chǎn)后感染、肺栓塞遠(yuǎn)期：盆腔粘連、子宮內(nèi)膜異位癥、影響子宮的解剖結(jié)構(gòu)、對(duì)身體及各器官的影響、再孕時(shí)剖宮產(chǎn)切口瘢痕處妊娠、子宮破裂,傷口愈合不良的危害,若傷口愈合不良，將給產(chǎn)婦帶來術(shù)中術(shù)后出血、術(shù)后切口感染、切口裂開等危害，并增加慢性盆腔痛、盆腔粘連、子宮內(nèi)膜異位

3、癥、剖宮產(chǎn)瘢痕妊娠(CSP)、繼發(fā)不育、流產(chǎn)的發(fā)生率。,傷口愈合過程,治療現(xiàn)狀,基因工程的應(yīng)用生物工程材料的使用納米技術(shù)的應(yīng)用中西醫(yī)結(jié)合技術(shù)的應(yīng)用創(chuàng)面覆蓋物的應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)輔助治療激光刺激高壓氧治療其他治療方法: 心理治療、 真空輔助創(chuàng)口愈合技術(shù),膠原蛋白,膠原蛋白體外應(yīng)用有改善表皮細(xì)胞微循環(huán)和促進(jìn)皮膚組織新陳代謝的作用，從而加速組織再生與修復(fù)。膠原蛋白含有豐富的細(xì)胞代謝所需的氨基酸，可改善皮膚細(xì)胞的生存環(huán)境，促進(jìn)皮膚組織的

4、新陳代謝。,海洋膠原肽(MCP),海洋膠原肽：氨基酸組成均衡、全面，有很好的溶解性、低黏度、高濃度、水溶性、熱穩(wěn)定性，在體內(nèi)吸收快、利用率高。國(guó)內(nèi)外已有部分研究論證了海洋生物活性肽對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有抗損傷和抗氧化等功效。我們課題組以往的研究表明：海洋低聚肽具有延緩皮膚衰老、保護(hù)腎功能、調(diào)節(jié)血糖、改善老年記憶、調(diào)節(jié)免疫、防輻射及預(yù)防骨質(zhì)疏松的活性；海洋膠原肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可以清除體內(nèi)的自由基，減少炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)小鼠免疫功能，進(jìn)而增

5、強(qiáng)抗感染能力。,二、研究目的,觀察MCP對(duì)傷口愈合的影響 探討MCP促進(jìn)愈合的作用機(jī)制,三、材料和方法,受試物：海洋膠原肽 淡黃色粉末，由北京中食海氏生物技術(shù)有限公司提供。以深海魚的魚皮為主要原料，經(jīng)過清洗勻漿-復(fù)合偶聯(lián)酶解-酶失活-脫脂-多級(jí)膜分離-滲透精制-濃縮-脫色-造粒干燥等工藝制成。 根據(jù)我們課題組以往實(shí)驗(yàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)立0.13g/kg.bw、0.38g/kg.bw、1.15g/kg.

6、bw三個(gè)MCP劑量組，對(duì)照組給予等體積溶劑灌胃。,材料,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物孕16天的健康SD大鼠350~400gSPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)飼養(yǎng)環(huán)境溫度21~23℃濕度50%~60%RH,材料,主要儀器,UV7512GD型紫外可見分光光度計(jì)超速離心機(jī)XHC型漩渦混勻器電子天平光學(xué)顯微鏡－80℃低溫冰箱Pclab-UE生物醫(yī)學(xué)信號(hào)采集處理系統(tǒng),主要試劑,羥脯氨酸測(cè)試盒FGF抗體TGF-β1抗體CD31兔二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒

7、濃縮型DAB試劑盒其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純,實(shí)驗(yàn)方法,動(dòng)物分組及處理96只孕16天的SD大鼠，隨機(jī)分為4組，每組24只，均給予基礎(chǔ)飼料。經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，在孕19天進(jìn)行剖宮產(chǎn)手術(shù)，手術(shù)當(dāng)天在基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上增加灌胃。低劑量MCP組，術(shù)后每天給予0.13 g/kg.bw劑量的海洋膠原肽灌胃；中劑量MCP組，術(shù)后每天給予0.38g/kg.bw劑量的海洋膠原肽灌胃；高劑量MCP組，術(shù)后每天給予1.15g/kg.bw劑量的海洋膠原

8、肽灌胃；空白對(duì)照組，術(shù)后每天灌胃相同體積的生理鹽水。,實(shí)驗(yàn)方法,手術(shù)方案 1%苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉，在下腹部沿腹中線切開3cm 縱切口，打開腹腔，在兩側(cè)子宮背對(duì)腸系膜側(cè)的中部各做2.0cm的縱向切口，擠出大鼠幼崽和胎盤。用5-0可吸收性外科腸線連續(xù)縫合，深腹、筋膜、腹膜用4-0絲線縫合，皮膚用4-0絲線縫合。術(shù)后涂2%碘酊，注射青霉素0.1ml，放回鼠籠里，注意保暖，術(shù)后禁食1天，正常飲水。,實(shí)驗(yàn)方法,樣品的收集在術(shù)后7天、14天

9、、21天每組分別取8只大鼠，頸椎脫臼法處死動(dòng)物，取傷口皮膚、子宮組織，稱重后，1/2用于測(cè)量力學(xué)指標(biāo)，1/4放入液氮中迅速冷凍，-80℃冰箱中保存。剩下的1/4組織用10%中性甲醛固定后，備用。,觀察指標(biāo),一般指標(biāo)：大鼠的一般情況、傷口愈合的時(shí)間、肉眼觀察情況。每周記錄大鼠體重及攝食量，每3天測(cè)量大鼠腰圍，臟器收集時(shí)觀察腹部的粘連情況，對(duì)粘連情況進(jìn)行分級(jí)判斷，同時(shí)記錄子宮重量。力學(xué)指標(biāo)：皮膚張力和子宮破裂壓力。羥脯氨酸含量：樣本堿水

10、解法。病理組織學(xué)檢查： HE染色、膠原染色。細(xì)胞因子的表達(dá)：免疫組織化學(xué)染色。,統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(?x?s)表示數(shù)據(jù)采用SPSS13.0處理計(jì)量資料采用T檢驗(yàn)、單因素方差分析組間的粘連情況采用秩和檢驗(yàn)檢驗(yàn)水平α=0.05,四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果,1 一般指標(biāo)1.1 大鼠的一般情況實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠無死亡，未出現(xiàn)拒食現(xiàn)象，動(dòng)物生長(zhǎng)及活動(dòng)正常，行為、毛色、精神狀況、飲食、飲水及糞便均未見明顯異常。,1.2傷口愈合時(shí)

11、間與肉眼觀察情況,,傷口的平均愈合時(shí)間為6~7d。灌胃海洋膠原肽實(shí)驗(yàn)組大鼠的傷口，比對(duì)照組大鼠傷口能提前1-2天愈合。,,肉眼觀察傷口愈合良好，未發(fā)現(xiàn)紅腫、積液、皮膚壞死、切口破裂等不良反應(yīng)。MCP組傷口愈合后，與對(duì)照組相比，傷口表面光滑無結(jié)痂。因此認(rèn)為膠原肽對(duì)傷口愈合起著顯著的愈合作用。,1.3 對(duì)大鼠體重及攝食量的影響,體重?cái)?shù)據(jù)顯示各實(shí)驗(yàn)組大鼠的體重顯現(xiàn)出先減少再增加的趨勢(shì)，與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。,,

12、1.4 對(duì)大鼠腰圍的影響,各實(shí)驗(yàn)組大鼠的腰圍均呈現(xiàn)出一個(gè)先下降后回升至穩(wěn)定水平的趨勢(shì)，各MCP劑量組數(shù)據(jù)與空白對(duì)照組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。,1.5 對(duì)大鼠腹部粘連情況的影響,對(duì)大鼠腹部的粘連情況進(jìn)行分級(jí)，大鼠多為中度粘連，采用單向有序分類變量秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量Hc=0.359， p＞0.05，可以認(rèn)為，各實(shí)驗(yàn)組大鼠腹部粘連情況的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。,1.6 對(duì)大鼠子宮重量的影響,2 力學(xué)指標(biāo),對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分

13、析，結(jié)果表明中劑量組在21天時(shí)皮膚張力高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；高劑量組7天和21天的皮膚張力均高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。,2 力學(xué)指標(biāo),子宮壓力的數(shù)據(jù)表明，低劑量組和中劑量組的子宮壓力與空白對(duì)照組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。而高劑量組在在7天、21天時(shí)子宮壓力均大于對(duì)照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。,3 對(duì)羥脯氨酸含量的影響,4 組織病理學(xué)檢查,

14、鏡下可見較多的中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞間質(zhì)疏松，新生的毛細(xì)血管芽和成纖維細(xì)胞增生不明顯。,鏡下可見較多的中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，有新生的毛細(xì)血管芽和成纖維細(xì)胞增生。大量成纖維細(xì)胞呈梭狀，細(xì)胞質(zhì)豐富，胞核較大，呈橢圓形，核仁明顯。,HE染色：術(shù)后14天,鏡下可見仍有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)長(zhǎng)梭狀的纖維細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯，膠原纖維增生不明顯。,鏡下可見大量細(xì)長(zhǎng)梭狀纖維細(xì)胞和大量束狀排列膠原

15、纖維增生。,HE染色：術(shù)后第21天,傷口表皮以增生為主，瘢痕組織較多，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較多。,傷口表皮完整，瘢痕組織明顯少于對(duì)照組，炎性細(xì)胞明顯減少。,膠原染色,MCP組有大量膠原纖維束及波浪形的彈性纖維， MCP組膠原纖維數(shù)量明顯多于對(duì)照組，且排列整齊。,5 免疫組化檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá),5.1 傷口組織中TGF-β1的表達(dá),,術(shù)后第14、21天的傷口組織中TGF-β1表達(dá)顯著高于對(duì)照組(p<0.05)。,5.2 傷口組織中bFGF的

16、表達(dá),術(shù)后第7、14天高劑量組傷口組織中bFGF的表達(dá)均高于空白對(duì)照組，差異有顯著性(p<0.05)。,5.3 傷口組織中CD31的表達(dá),CD31陽性反應(yīng)出現(xiàn)在血管內(nèi)皮細(xì)胞，用來標(biāo)記微血管，7d時(shí)達(dá)到峰值，之后便呈減少趨勢(shì)，14、21d沒有發(fā)現(xiàn)差異性。,五、討論,1 關(guān)于動(dòng)物模型和指標(biāo)的選擇 動(dòng)物模型：對(duì)孕鼠進(jìn)行剖宮產(chǎn)術(shù)，建立剖宮產(chǎn)術(shù)動(dòng)物模型，模擬了臨床剖宮產(chǎn)情況，形成組織形態(tài)與生物學(xué)與人剖宮產(chǎn)近似的傷口組織，再現(xiàn)了剖宮產(chǎn)術(shù)

17、后傷口愈合的過程。剖宮產(chǎn)動(dòng)物模型在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較少，本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性的將剖宮產(chǎn)術(shù)大鼠模型應(yīng)用于MCP對(duì)傷口愈合影響的研究，這在國(guó)內(nèi)尚屬首例。 力學(xué)指標(biāo)：在本研究中，我們基于剖宮產(chǎn)術(shù)動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，由力學(xué)角度分析MCP對(duì)傷口愈合的影響，新增加了皮膚張力和子宮破裂壓力指標(biāo)的測(cè)定，二者都是定量的指標(biāo)，能夠更加準(zhǔn)確的反應(yīng)皮膚和子宮傷口抗拉力和伸展強(qiáng)度，明確判斷傷口愈合的好壞，正確的反應(yīng)MCP對(duì)傷口愈合的影響，使得本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更加科學(xué)、可信度

18、較強(qiáng)。,2 MCP對(duì)傷口愈合的作用,2.1 對(duì)一般情況的影響實(shí)驗(yàn)期間大鼠無死亡，狀態(tài)良好，一般情況及病理均未出現(xiàn)明顯異常，說明MCP在本試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)是安全的，對(duì)動(dòng)物不產(chǎn)生毒副作用。各劑量組和空白對(duì)照組的體重、腰圍、攝食量、子宮重量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且體重、腰圍、及子宮重量的變化均呈現(xiàn)出由高到低的變化趨勢(shì)，與各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的生理狀況相吻合，符合孕鼠產(chǎn)后身體及子宮復(fù)舊的正常生理變化，說明MCP不影響孕鼠正常的身體恢復(fù)。,2 MCP對(duì)傷口

19、愈合的作用,2.2 縮短傷口愈合時(shí)間 本研究結(jié)果表明MCP組大鼠傷口愈合的時(shí)間明顯小于對(duì)照組，這說明MCP可以縮短傷口組織愈合的時(shí)間，減少產(chǎn)婦術(shù)后傷口治療的過程，對(duì)于減少住院時(shí)間，降低醫(yī)療費(fèi)用有一定的意義。2.3 增加傷口組織的力學(xué)指標(biāo) 本研究結(jié)果表明MCP能增加術(shù)后傷口皮膚張力和子宮破裂壓力，這對(duì)于剖宮產(chǎn)婦來說極為重要。術(shù)后傷口皮膚張力和子宮破裂壓力的增加，意味著產(chǎn)婦術(shù)后傷口愈合良好，皮膚的伸展性恢復(fù)得較好，抗拉

20、力的強(qiáng)度增大，可以承受住剖宮產(chǎn)術(shù)后再次妊娠，從而減少CSP的發(fā)生，降低剖宮產(chǎn)術(shù)后再次妊娠的風(fēng)險(xiǎn)。,2 MCP對(duì)傷口愈合的作用,2.4 對(duì)傷口組織形態(tài)學(xué)的影響MCP能增加早期傷口組織中新生毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞的生成，縮短傷口愈合過程中的炎癥反應(yīng)期，促進(jìn)傷口組織成纖維細(xì)胞及早形成，促進(jìn)血管再生，從而改善傷口組織中微循環(huán)，增加局部供氧，促進(jìn)微血管和膠原生成，加快傷口愈合。,3 MCP促進(jìn)傷口愈合的機(jī)制,1 增加氨基酸原料的供給。

21、 創(chuàng)傷愈合的一個(gè)重要過程，是成纖維細(xì)胞利用氨基酸原料，合成膠原蛋白，如果氨基酸原料供給不足，必將造成愈合延遲。羥脯氨酸是構(gòu)成結(jié)締組織膠原的重要成分，對(duì)膠原蛋白分子在生理溫度下形成三股螺旋的繩狀結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性具有重要意義，其含量多少與結(jié)締組織的抗拉力強(qiáng)度有很大關(guān)系。本研究中高劑量組皮膚傷口中羥脯氨酸的含量在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均高于對(duì)照組，說明MCP能夠能夠提供充足的氨基酸原料，促進(jìn)傷口中羥脯氨酸含量的增加，從而利于膠原蛋白的合成，增加膠原蛋白

22、分子的穩(wěn)定性，增強(qiáng)皮膚的抗拉力強(qiáng)度，促進(jìn)傷口愈合。我們課題組以往的研究表明MCP可通過促進(jìn)傷口皮膚膠原蛋白的合成，從而促進(jìn)傷口愈合，結(jié)論與本研究相一致。,3 MCP促進(jìn)傷口愈合的機(jī)制,2 促進(jìn)傷口愈合的修復(fù)細(xì)胞的形成，特別是增加參與肉芽組織形成的成纖維細(xì)胞。 本實(shí)驗(yàn)傷口7天的病理學(xué)檢查和免疫組化結(jié)果均表明成纖維細(xì)胞的數(shù)量和膠原纖維的含量明顯增加，MCP可通過增加成纖維細(xì)胞的數(shù)量和膠原纖維的含量，從而促進(jìn)傷口的愈合。,3 MCP

23、促進(jìn)傷口愈合的機(jī)制,3 為皮膚提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 傷口愈合的過程需要以營(yíng)養(yǎng)為基礎(chǔ)，而MCP可以增加新生血管的形成，改善血循環(huán)，增加傷口組織局部營(yíng)養(yǎng)，為傷口愈合提供充足的營(yíng)養(yǎng)。4 縮短愈合過程中的炎性反應(yīng)期。 MCP可在早期增加傷口組織中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，縮短愈合過程中的炎性反應(yīng)期，從而縮短愈合時(shí)間，促進(jìn)傷口愈合。,3 MCP促進(jìn)傷口愈合的機(jī)制,5 促進(jìn)生長(zhǎng)因子表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MCP可以增強(qiáng)TGF-β1、bFGF、

24、CD31的表達(dá)，提示在傷口的愈合過程中：（1）MCP可能通過增強(qiáng)TGF-β1的表達(dá)，促進(jìn)產(chǎn)生膠原纖維和ECM，誘導(dǎo)肉芽組織生長(zhǎng)和表皮形成，來促進(jìn)傷口的愈合。（2）MCP可增強(qiáng)傷口組織中bFGF的表達(dá)，并維持在較高的水平，從而增加新生血管的形成，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞增生，參與炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)，縮短傷口愈合時(shí)間，促進(jìn)傷口的愈合。（3）MCP組微血管計(jì)數(shù)（CD31）在7d時(shí)顯著高于對(duì)照組，而且病理學(xué)觀察也發(fā)現(xiàn)術(shù)后7dMCP組毛

25、細(xì)血管數(shù)量最多，說明MCP能增加毛細(xì)血管的數(shù)量，為創(chuàng)面的快速愈合提供了良好的血供，從而促進(jìn)傷口的愈合。,六、結(jié) 論,MCP對(duì)傷口愈合有明顯的促進(jìn)作用MCP可以促進(jìn)膠原蛋白的合成MCP可以提高傷口皮膚的張力 MCP能增強(qiáng)子宮的壓力MCP可影響傷口組織中TGF-β1、bFGF、CD31的表達(dá)，通過促進(jìn)血管形成、炎癥反應(yīng)發(fā)揮其促進(jìn)傷口愈合的作用,,目前，剖宮產(chǎn)率居高不下并有逐漸升高的趨勢(shì)，傷口愈合不良，將減緩愈合過程，增加產(chǎn)后并發(fā)癥