產(chǎn)功能性油脂真菌菌株的篩選及發(fā)酵研究.pdf

1、營養(yǎng)研究表明，在膳食中攝入長鏈多不飽和脂肪酸對人體有潛在的益處，ω-3系列脂肪酸，包括EPA、DHA，可能對冠心病的預(yù)防有很大作用，又如γ-亞麻酸長期被推薦用來治療各種疾病。這些脂肪酸人體不能合成，只能通過膳食獲得。通過傳統(tǒng)的方法獲取這些必須脂肪酸成本較高而產(chǎn)量卻很低，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)多不飽和脂肪酸是一項(xiàng)具有發(fā)展前景的新興產(chǎn)業(yè)，但要想實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)還需在高產(chǎn)菌株的篩選、發(fā)酵工藝的改進(jìn)以及多不飽和脂肪酸的提取等方面進(jìn)行系統(tǒng)研究。

2、　　本文從土壤中產(chǎn)多不飽和脂肪酸真菌的篩選和鑒定開始，通過對多份土樣進(jìn)行初步分離，篩選出具有較好合成多不飽和脂肪酸能力的菌株后進(jìn)行基因型鑒定，并通過對其發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化進(jìn)行系統(tǒng)的代謝調(diào)控的研究，初步探索大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的條件，以期為微生物產(chǎn)多不飽和脂肪酸的小型化工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　(1)采集的土樣經(jīng)梯度稀釋法分離和平板劃線分離純化獲得菌株并保存，共得到147株真菌菌株。經(jīng)平板劃線后挑取菌絲進(jìn)行蘇丹黑染色得到的39株菌

3、株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵初篩，培養(yǎng)4d開始連續(xù)每天染色觀察胞內(nèi)脂肪粒的生成情況并測定發(fā)酵液中的殘?zhí)橇?，?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)編號WHJ-13，HNH-14，WHJ-20，WHJ-18，WHN-M以及WHZ-15的菌絲體染色后脂肪粒著色較其他菌株更深。
　　(2)將搖瓶發(fā)酵初篩得到的12株產(chǎn)油脂菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，培養(yǎng)7d后，收集菌體，測生物量、抽提粗脂肪，計(jì)算油脂得率。菌株FP油脂含量最高(達(dá)35.58％)，可能含有功能性不飽和脂肪酸成分，具有進(jìn)一步研究的

4、價值。
　　(3)菌體經(jīng)索氏抽提法抽提粗油脂并甲酯化后，對12株產(chǎn)油菌株的油脂脂肪酸組成及含量進(jìn)行氣相色譜法分析產(chǎn)油菌株的油脂脂肪酸組成及產(chǎn)量。試驗(yàn)可得這12株產(chǎn)油菌株很少產(chǎn)C14∶0以下的脂肪酸，但C16∶0，C18∶1及C18∶2含量都較高，均在10％以上，與植物脂肪酸組成相似，綜合搖瓶復(fù)篩12支菌株的生物量、油脂含量、油脂得率、總PUFAs含量以及亞麻酸含量篩選出WHJ-13具有較高產(chǎn)功能性油脂的潛力。
　　(4)將菌

5、株FP接種PDA培養(yǎng)基上25℃倒置培養(yǎng)3d出現(xiàn)清晰可見直徑約1cm的單菌落，培養(yǎng)4d氣生菌絲呈白色羊毛狀，菌落中心薄而疏松，外緣菌絲飽滿、致密，表明干燥;顯微鏡下分生孢子有兩種形態(tài):小型分生孢子呈橢圓形或卵形;電鏡觀察菌絲內(nèi)有油脂滴;對菌株ITS片段進(jìn)行擴(kuò)增和測序，并與武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)聯(lián)合鑒定為鐮刀霉菌屬。
　　(5)以標(biāo)準(zhǔn)品亞油酸(LA)和γ-亞麻酸(GLA)的濃度(A)為橫坐標(biāo)，定量脂肪酸甲酯的峰面

6、積(P)為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此建立的亞油酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1659.50X+201.10，R2=0.9996;γ-亞麻酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=823.55X+8.87，R2=0.9996。
　　(6)在發(fā)酵條件優(yōu)化的試驗(yàn)中，初步探討了各種發(fā)酵培養(yǎng)條件對菌株FP產(chǎn)油脂的影響，最終優(yōu)化得到菌株的發(fā)酵條件為:接種量6％，轉(zhuǎn)速150r/min，初始pH為6，裝液量100mL，發(fā)酵溫度為28℃，種子液接種時間為48h，接入發(fā)酵培養(yǎng)基確定最終

7、發(fā)酵時間為7d。經(jīng)優(yōu)化后，菌株FP油脂得率為2.47g/L，與接入基本發(fā)酵培養(yǎng)基時的出發(fā)株1.455g/L相比，提高69.72％;亞油酸(LA)和γ-亞麻酸(GLA)的產(chǎn)量分別提高了近1倍和2倍。
　　(7)初步探討了各種營養(yǎng)條件對菌株FP產(chǎn)油脂的影響，最終優(yōu)化得到菌株的營養(yǎng)成分單因素最優(yōu)條件為:葡萄糖4.45％、酵母膏0.95％、菜籽油的添加1.5％，選擇KH2PO4、CaCl2、MgSO4添加量分別為3g/L、500mg/L、