柴達(dá)木盆地黑果枸杞F3′5′H基因啟動(dòng)子克隆與活性分析.pdf

1、黑果枸杞主要分布于我國(guó)青海、寧夏、新疆等西部偏遠(yuǎn)地區(qū)，是我國(guó)西北地區(qū)特有的保持水土和緩解土壤鹽堿化的理想植物。其黑色的果實(shí)中所含的大量花青素具有重要的醫(yī)療保健作用。類黃酮-3′，5′-羥化酶合成基因（F3′5′H基因）是合成使黑果枸杞果實(shí)呈黑色的矮牽牛色素的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因。為闡明F3′5′H基因的表達(dá)機(jī)理，明晰F3′5′H基因在黑果枸杞呈色中的作用，確定黑果枸杞及其白化果實(shí)中F3′5′H基因啟動(dòng)子的活性，最終揭示黑果枸杞及其白化果實(shí)呈色差

2、異的原因。本研究以黑果枸杞果實(shí)為研究對(duì)象，以其白化果實(shí)為對(duì)照，首先確定了兩者中F3′5′H基因的表達(dá)模式，繼而克隆黑果枸杞果實(shí)F3′5′H基因全長(zhǎng)cDNA序列，以該序列為模板，設(shè)計(jì)引物克隆兩者中F3′5′H基因的啟動(dòng)子。將啟動(dòng)子與GUS基因融合構(gòu)建植物瞬時(shí)表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草葉片，煙草培養(yǎng)后進(jìn)行組織化學(xué)染色以確定啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性。結(jié)果如下：
　　1.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）技術(shù)檢

3、測(cè)了F3′5′H基因在黑果枸杞及其白化果實(shí)中不同時(shí)期的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)在S2-S5時(shí)期，其在黑果枸杞果實(shí)中的表達(dá)量明顯高于白化果實(shí)中的表達(dá)量。
　　2.利用RACE技術(shù)克隆得到長(zhǎng)為1689bp的黑果枸杞F3′5′H基因的全長(zhǎng)cDNA序列，其中包含長(zhǎng)度為1527bp可編碼508個(gè)氨基酸的編碼區(qū)。對(duì)該全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼的氨基酸以及蛋白質(zhì)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)黑果枸杞F3′5′H基因的保守性較高，F(xiàn)3′5′H蛋白為非分泌蛋白，多

4、肽鏈內(nèi)部含有57個(gè)磷酸化位點(diǎn)，且蛋白為親水性蛋白。
　　3.利用Genome Walking Kit（TaKaRa）試劑盒通過(guò)3次染色體步移克隆出黑果枸杞及其白化果實(shí)F3′5′H基因的啟動(dòng)子片段并測(cè)序。利用DNA MAN軟件分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)啟動(dòng)子序列的同源性高達(dá)90.3％，通過(guò)在線分析網(wǎng)站Plant Care對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩者中均具有多個(gè)普遍存在于真核生物啟動(dòng)子中的基本元件如TATA-Box及CAAT-Box。除此之外，還

5、有防御和脅迫應(yīng)答元件TC-rich repeats、創(chuàng)傷響應(yīng)元件WUN-motif以及多個(gè)與光響應(yīng)相關(guān)的元件Sp1、Box I和G-box等。還存在一些其他類型的元件，如與胚乳表達(dá)相關(guān)的元件skin-1 motif和厭氧誘導(dǎo)元件ARE。另外在黑果枸杞啟動(dòng)子中預(yù)測(cè)到與茉莉酸甲酯響應(yīng)相關(guān)的元件TGACG-motif，而在黑果枸杞白化果實(shí)啟動(dòng)子中沒(méi)有預(yù)測(cè)到。
　　4.分別將2個(gè)啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因融合以構(gòu)建植物瞬時(shí)表達(dá)載體，進(jìn)而利用農(nóng)