雞MTNR1A基因啟動(dòng)子克隆及活性分析.pdf

1、MTNR1A基因編碼褪黑激素受體1A，是影響雞產(chǎn)蛋性狀的候選基因。通過(guò)對(duì)MTNR1A基因啟動(dòng)子區(qū)的功能分析，有助于從分子水平上了解MTNR1A基因可能的調(diào)控序列及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步了解褪黑激素參與生殖調(diào)控的作用機(jī)制也有一定作用。
　　本試驗(yàn)以海蘭褐殼蛋雞為研究對(duì)象，采用PCR方法擴(kuò)增了雞MTNR1A基因5’調(diào)控區(qū)3134bp到205bp長(zhǎng)度不同、下游引物相同的七個(gè)片段，對(duì)其進(jìn)行克隆、測(cè)序后，構(gòu)建了七個(gè)啟動(dòng)子報(bào)告基因表達(dá)載體，瞬

2、時(shí)轉(zhuǎn)染雞卵泡膜細(xì)胞，應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定了熒光素酶相對(duì)活性，并對(duì)產(chǎn)生作用的區(qū)段進(jìn)行生物信息學(xué)分析。同時(shí)，PCR擴(kuò)增31只雞MTNR1A基因5’調(diào)控區(qū)-941~+107區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，尋找其SNP位點(diǎn)，對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行遺傳學(xué)分析，并對(duì)突變前后基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：
　?。?）-243~-39區(qū)段能表達(dá)MTNR1A基因啟動(dòng)子的基本活性。生物信息學(xué)分析表明，該區(qū)域包含TATA box、CCAAT box等典型

3、的核心啟動(dòng)子元件。表明-243~-39區(qū)段對(duì)該基因的表達(dá)調(diào)控起重要作用。
　?。?）啟動(dòng)子分析載體由-553~-39刪除至-243~-39時(shí)，熒光素酶活性顯著下降，表明-553~-243間有增強(qiáng)MTNR1A基因表達(dá)的作用元件。該區(qū)域存在多個(gè)SP1結(jié)合位點(diǎn)和USF結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)這兩種結(jié)合位點(diǎn)對(duì)-553~-243區(qū)域活性增強(qiáng)起重要作用。
　　（3）啟動(dòng)子分析載體由-1963~-39刪除至-1525~-39時(shí)，熒光素酶結(jié)果顯著升高

4、，表明-1963~-1525間有降低MTNR1A基因表達(dá)的作用元件。推測(cè)該區(qū)域的AP-1結(jié)合位點(diǎn)、HNF-1結(jié)合位點(diǎn)、USF結(jié)合位點(diǎn)及Arnt反式作用因子發(fā)揮降低啟動(dòng)子活性的作用。
　?。?）啟動(dòng)子分析載體由-2373~-39刪除至-1963~-39時(shí)，熒光素酶活性顯著降低，表明從-2373~-1963區(qū)域中存在增強(qiáng)MTNR1A基因表達(dá)的作用元件。推測(cè)該區(qū)域的TATA box、AP-1結(jié)合位點(diǎn)、c-Myb結(jié)合位點(diǎn)、USF結(jié)合位點(diǎn)和

5、Oct-1反式作用因子起到增強(qiáng)-2373~-1963區(qū)域活性的作用。
　?。?）啟動(dòng)子-941~+107區(qū)域存在6個(gè)SNPs位點(diǎn)：-34（C→T），-100(T→G)，-110(T→C)，-126(C→T)，-151(G→A)，-538(T→G)，處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。其中2個(gè)突變可能造成轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的改變。
　　綜上所述，本試驗(yàn)證明MTNR1A基因-553~-243和-2373~-1525區(qū)段是調(diào)控