山羊、牛MyoG啟動子序列克隆及其活性分析.pdf

1、肌細胞生成素(myogenin，MyoG)是生肌調節(jié)因子(MRFs)基因家族中唯一能在骨骼肌細胞發(fā)育與生長過程中均可表達的調控因子，在肌肉細胞分化過程中起著中心調控的作用，它正調控著骨骼肌衛(wèi)星細胞向成熟肌細胞分化的過程，是唯一不可代替的生肌調節(jié)因子。MyoG基因在復制、擴增、基因激活、轉錄、翻譯等多級水平上對肌肉發(fā)育進行調控?；蜣D錄的起始階段是機體生長發(fā)育因子進行調控的開端，而此階段調控的實質是通過啟動子和上游調控序列的相互作用，調控

2、目的基因的表達。因此克隆MyoG基因的啟動子，探討啟動子區(qū)域的啟動活性，有助于從理論上揭示MyoG基因表達的關鍵調控位點，同時也有利于揭示肌肉發(fā)育調控的相關機理，為治療人類相關疾病以及改良家畜肉質研究提供實驗依據(jù)。
　　本研究分別克隆了山羊和牛的MyoG啟動子序列，并構建了真核表達載體pDsRed-GoatMyoG和pDsRed-BosMyoG，通過脂質體介導法將表達載體轉染不同種類細胞，然后采用實時熒光定量PCR技術、Weste

3、rnBlot技術和免疫組化技術檢測MyoG啟動子在不同體外培養(yǎng)細胞中啟動外源基因的特異性和啟動效率。同時，將表達質粒注射到雄鼠股骨內側肌肉內，檢測啟動子在活體組織內的表達特異性和啟動效率。
　　1.MyoG啟動子的克隆和肌肉特異表達載體的構建
　　分別克隆出山羊和牛MyoG基因的啟動子序列，與NCBI-BLAST已報道序列進行比對，同源性為100％;兩種MyoG啟動子分別連入pDsRed2-1骨架構建了以紅熒光蛋白基因為標記

4、基因的真核表達載體pDsRed-GoatMyoG和pDsRed-BosMyoG，經酶切和測序鑒定，證實載體構建成功。
　　2.MyoG啟動子組織特異性及啟動效率檢測
　　表達載體pDsRed-GoatMyoG、pDsRed-BosMyoG分別轉染體外培養(yǎng)的綿羊肌衛(wèi)星細胞、肌管細胞和成纖維細胞，觀察紅色熒光蛋白表達情況，然后利用實時熒光定量PCR和WesternBlot技術檢測細胞轉染后標記基因mRNA和蛋白水平的表達效率。結

5、果表明，轉染質粒pDsRed-GoatMyoG、pDsRed-BosMyoG后，肌衛(wèi)星細胞和肌管細胞在顯微鏡下均可觀察到細胞發(fā)紅色熒光，成纖維細胞沒有紅色熒光。通過實時熒光定量PCR檢測得出，轉基因肌管細胞內GoatMyoG啟動DsRed基因表達mRNA的相對量為14.07，BosMyoG啟動DsRed基因mRNA相對量為9.02，GoatMyoG啟動外源基因的效率是BosMyoG的1.55倍;通過WesternBlot技術檢測得出轉基

6、因肌管細胞內GoatMyoG啟動DsRed蛋白的量明顯高于BosMyoG啟動DsRed蛋白的量，在成纖維細胞內沒有檢測到DsRed蛋白質。說明GoatMyoG啟動子在肌衛(wèi)星細胞和肌管細胞內啟動外源基因的效率高于BosMyoG啟動子的啟動效率，且均可在肌肉組織特異性啟動外源基因表達。
　　選擇啟動效率相對較高的GoatMyoG啟動子所構建的表達載體對小鼠進行肌肉注射，檢測GoatMyoG啟動子在體內組織中的啟動特異性和效率。肌肉注射

7、五天后，分別取小鼠的注射腿肌肉組織、非注射腿肌肉組織、睪丸組織、腸組織和肝臟組織，通過實時熒光定量PCR檢測標記基因DsRed在不同組織中的表達情況。結果表明，注射腿肌肉組織內GoatMyoG啟動DsRed基因轉錄mRNA的相對量為212.32，非注射腿肌肉組織內mRNA的相對量為39.76，注射腿肌肉組織和非注射腿肌肉組織內mRNA的量均是其它組織的1.99倍以上。通過免疫組化技術在注射腿肌肉組織和非注射腿肌肉組織內均可檢測到紅色熒光