亮氨酸應答調控因子Lrp調控抗生素生物合成的分子機制及應用.pdf

1、Lrp(Leucine-responsive regulatory protein)家族，又被稱為Lrp/AsnC家族，是一類廣泛存在于原核生物中的轉錄調控因子，能夠參與調控細胞的多個生理過程，包括氨基酸的代謝、胞內外物質的轉運、DNA的修飾與重組、細菌抗性等多個方面。然而目前在產抗生素的放線菌中關于Lrp蛋白調控抗生素生物合成的研究非常少，具體的調控機制更是有待深入的探究。紅霉素(Erythromycin)是一種大環(huán)內酯類抗生素，由放

2、線菌(Actinomycete)中糖多孢紅霉菌(Saccharopolyspora erythraea)次生代謝產生，對于多種致病菌都具有較強大的抗菌活性。根據(jù)生物信息學分析，糖多孢紅霉菌中SACE_Lrp(SACE_5388)基因編碼一種Lrp家族的同源蛋白，與已報道的谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)中Lrp同源性高達56％，并且它們轉錄方向相反的鄰近基因都是編碼分支氨基酸ABC轉運蛋白。本研究主

3、要內容包括：
　　⑴利用大腸桿菌體外表達技術得到可溶性的SACE_Lrp蛋白，通過蛋白與DNA結合的EMSA實驗證實了SACE_Lrp對鄰近的SACE_5387-5386具有直接的調控作用。為了探究SACE_Lrp在糖多孢紅霉菌中的功能，我們通過大片段敲除技術在糖多孢紅霉菌A226中構建了SACE_Lrp缺失突變株。高效液相色譜分析表明，與出發(fā)菌株A226相比，SACE_Lrp缺失突變株（ΔSACE_Lrp）中紅霉素產量提高了25

4、％，而SACE_Lrp基因回補后，紅霉素的產量回復到出發(fā)菌株的水平，同時在A226中對SACE_Lrp過表達后紅霉素產量相比出發(fā)菌株下降23％，說明SACE_Lrp對紅霉素生物合成具有負調控作用。SACE_Lrp的缺失對糖多孢紅霉菌的菌體生長和形態(tài)分化并無明顯的影響。進一步的qRT-PCR分析顯示，SACE_Lrp缺失突變株中紅霉素生物合成基因簇中基因eryAI和ermE、鄰近的分支氨基酸ABC轉運蛋白基因SACE_5387-5386以

5、及分支氨基酸代謝路徑中氨基轉移酶基因ilvE的轉錄水平都有顯著升高，表明SACE_Lrp很可能通過調節(jié)紅霉素結構基因、鄰近分支氨基酸轉運基因以及分支氨基酸代謝基因轉錄水平最終影響紅霉素的產生。利用氨基酸自動分析儀對A226與ΔSACE_Lrp的胞內外游離氨基酸分析結果表明，ΔSACE_Lrp中胞外三種分支氨基酸(Val、Ile和Leu)的含量低于A226，而ΔSACE_Lrp胞內三種分支氨基酸的含量也低于A226，說明SACE_Lrp的

6、缺失不僅影響分支氨基酸從胞外轉運至胞內，還影響了胞內分支氨基酸的代謝轉化，從而影響紅霉素生物合成的前體供應。我們在糖多孢紅霉菌A226中過量表達SACE_5387-5386，紅霉素產量提高了31％。進一步在糖多孢紅霉菌A226的發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加分支氨基酸后，紅霉素的產量相應提高47％(Val)、35％(Ile)和16％(Leu)。
　　⑵利用DNase I footprinting技術解析了糖多孢紅霉菌中SACE_Lrp的保守

7、結合位點為一段富含GC的DNA序列:CCTCCGGGCAACATTC，并通過缺失突變進行了驗證。根據(jù)保守結合位點的分布位置，推測SACE_Lrp不僅調控鄰近的轉錄方向相反的SACE_5387-5386，還可能具有自我調控的作用，本研究通過設計體內的GFP報告系統(tǒng)證實，SACE_Lrp對自身的轉錄存在轉錄抑制。Lrp家族的一大特征是C末端結構域具有響應配體氨基酸的能力，通過在體外EMSA體系中添加20種蛋白質氨基酸，發(fā)現(xiàn)添加Lys和Arg

8、可以抑制SACE_Lrp與靶DNA的結合，而添加His可以促進蛋白與靶DNA的結合，說明SACE_Lrp具有雙向響應的氨基酸配體，Lys和Arg是抑制型配體，His是促進型配體。進一步通過設計體內GFP報告系統(tǒng)，證實了SACE_Lrp在體內情況下同樣可以對三種配體氨基酸進行應答。目前為止，糖多孢紅霉菌SACE_Lrp是Lrp家族蛋白中首次被解析雙向響應配體的成員。糖多孢紅霉菌低產菌株A226中，SACE_Lrp的缺失、增加SACE_Lr

9、p靶基因SACE_5387-5386的拷貝數(shù)，以及添加SACE_Lrp調控底物分支氨基酸三種策略在提高紅霉素產量方面都取得了良好的效果。我們將這三種策略應用于紅霉素工業(yè)高產菌株WB。高效液相色譜分析表明，WB中缺失SACE_Lrp基因（WBΔSACE_Lrp）后，突變株紅霉素產量提高19％;在缺失SACE_Lrp基因的基礎上過量表達SACE_5387-5386（WBΔSACE_Lrp/5387-5386），紅霉素產量較出發(fā)菌株WB提高4

10、1％;在工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)中額外添加10 mM Val，WBΔSACE_Lrp/5387-5386的紅霉素產量較WB提高48％，最終在5-L發(fā)酵罐水平上，紅霉素的產量由3503 mg/L顯著提高41％，達到5001mg/L。說明在紅霉素工業(yè)高產菌株中，以SACE_Lrp調控元件為基礎的改造確實可以顯著的提高紅霉素的產量，這一調控元件的開發(fā)和應用為未來其他工業(yè)高產菌株的改造和篩選提供了基礎。
　　⑶根據(jù)同源性分析比對，SACE_Lrp的同

11、源蛋白廣泛存在于其他產抗生素的放線菌中，為了研究Lrp蛋白對于抗生素生物合成的調控功能是否具有普適性，我們選擇模式鏈霉菌-天藍色鏈霉菌作為代表。通過在天藍色鏈霉菌M145中缺失SACE_Lrp同源蛋白基因SCO3361，構建缺失突變株ΔSCO3361，并對次級代謝產物進行分析發(fā)現(xiàn)，SCO3361缺失突變后，放線紫紅素(Act)的產量急劇下降至出發(fā)菌株的20％水平，而十一烷基靈菌紅素(Red)和鈣依賴抗生素(CDA)的產量并無顯著變化。S

12、CO3361缺失突變后，菌株的產孢能力也明顯下降，說明SCO3361不僅調控天藍色鏈霉菌的次級代謝，還調控菌株的形態(tài)分化。這些結果說明在產抗生素的放線菌中，Lrp同源蛋白對于抗生物生物合成的調控作用是很可能普遍存在的。qRT-PCR分析結果顯示，SCO3361缺失突變株中Act生物合成基因簇的簇內調控蛋白基因actⅡ-ORF4(SCO5085)和產孢相關蛋白基因amfC(SCO4184)、whiB(SCO3034)、ssgB(SCO15

13、14)的轉錄水平明顯下降，說明SCO3361對Act的生物合成和菌株的孢子形成具有顯著的正調控作用;ΔSCO3361突變株中，自身基因表達量顯著升高，證實SCO3361同樣具有抑制自身轉錄的調控作用。EMSA實驗證實，SCO3361能夠結合actⅡ-ORF4的啟動子，說明SCO3361能夠直接調控Act的生物合成基因簇。通過qRT-PCR分析結合EMSA實驗發(fā)現(xiàn)SCO3361也同樣可以直接調控鄰近的轉錄方向相反的SCO3362。利用體外

14、EMSA和體內GFP報告系統(tǒng)，解析Phe是SCO3361的抑制型配體，Cys是SCO3361的促進型配體。EMSA實驗證實SACE_Lrp能夠與SCO3361的靶DNA結合，而SCO3361也能夠與SACE_Lrp的靶DNA結合，二者存在交叉調控的作用。我們的研究結果說明天藍色鏈霉菌中Lrp同源蛋白SCO3361不僅可以調控特定抗生素的生物合成，還調控了天藍色鏈霉菌的形態(tài)分化，說明Lrp家族蛋白在其他產抗生素的放線菌中同樣可以調控抗生素