寡糖合成的新策略——固相酶法合成和ManNAc立體選擇性合成的研究.pdf

1、寡糖是生物體內(nèi)重要的生物分子，與核酸，蛋白質(zhì)等生物大分子一樣在信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞間的識(shí)別與結(jié)合，細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，免疫應(yīng)答和病原體的感染等過(guò)程中有著重要的作用。與蛋白質(zhì)和核酸這兩類(lèi)生物大分子不同，寡糖的合成是非模板依賴(lài)型的合成。在這個(gè)過(guò)程中，不同糖基轉(zhuǎn)移酶和多種糖基供體構(gòu)建了一個(gè)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖世界。近些年，隨著分子克隆技術(shù)的日漸成熟和對(duì)模式生物基因組的深入了解，酶促合成寡糖技術(shù)日漸成熟。因其高度的區(qū)域選擇性和立體選擇性的特點(diǎn)，這種技術(shù)愈來(lái)愈被

2、人們重視。同時(shí)，在寡糖的酶法合成領(lǐng)域中，很多問(wèn)題需要解決與改進(jìn)。我們將這些問(wèn)題歸納為“5S”。即:1.酶的特異性、2.底物的水溶性、3.制備稀有的底物與輔助因子、4.分離純化、5.規(guī)模化。本文就是圍繞這5個(gè)問(wèn)題開(kāi)展課題的。本文的研究?jī)?nèi)容主要有以下幾方面:
　　本文介紹了兩種利用固相技術(shù)簡(jiǎn)化了寡糖酶法合成的分離過(guò)程。第一種方法是以pH敏感的水溶性線性高分子作為固相載體的化學(xué)酶法合成技術(shù)。這種載體有效的克服了固相載體影響酶與載體相互接

3、觸的問(wèn)題。利用這種載體，本文使用一鍋三酶體系原位生成稀有糖基供體CMP-Sia，成功地合成了Sia-LN三糖衍生物。這種三糖衍生物在流感病毒侵染宿主過(guò)程中起著決定性的作用，是下游分子生物學(xué)及藥物開(kāi)發(fā)研究中的重要研究對(duì)象。
　　基于第一種方法的優(yōu)點(diǎn)與不足，我們發(fā)展了第二代基于固相萃取技術(shù)的酶法合成策略。本策略的特點(diǎn)在于利用簡(jiǎn)單的“標(biāo)簽”技術(shù)無(wú)須任何前處理即可實(shí)現(xiàn)對(duì)酶法合成產(chǎn)物的純化。對(duì)比前人的研究，本方法有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):1.使用的“

4、標(biāo)簽”分子簡(jiǎn)單易得，便于擴(kuò)大規(guī)模;2.相較于傳統(tǒng)的固相載體，本方法反應(yīng)速率更快，反應(yīng)進(jìn)程更容易監(jiān)控;3.本方法后處理過(guò)程中不需要傳統(tǒng)方法中的脫鹽，濃縮等操作，也不需要傳統(tǒng)固相萃取方法中的后期純化，縮短了分離純化過(guò)程所需時(shí)間。為了證實(shí)方法的可行性，本文共利用了6種糖基轉(zhuǎn)移酶合成了5種不同的具有重要生物學(xué)意義的寡糖分子。更重要的是，通過(guò)引入另外2種水解酶，本方法首次實(shí)現(xiàn)了在固定相上對(duì)目標(biāo)化合物的純化，這一思路可以幫助未來(lái)人們?cè)O(shè)計(jì)出更加高效的

5、固相萃取策略。
　　為了更加高效地合成N-乙酰氨基甘露糖ManNAc及含有唾液酸的寡糖分子，本論文通過(guò)對(duì)底物扭張力的控制，首次報(bào)道了利用疊氮自由基對(duì)葡萄糖烯糖加成制備ManNAc衍生物的方法。通過(guò)高精度的計(jì)算，證實(shí)了本課題的設(shè)計(jì)思想及對(duì)反應(yīng)機(jī)理的假設(shè)。首先扭張力在動(dòng)力學(xué)控制的自由基立體選擇性加成過(guò)程中控制并決定了過(guò)渡態(tài)的選擇性，從而決定了產(chǎn)物的立體選擇性。其次，在熱力學(xué)控制的立體選擇性加成過(guò)程中，反應(yīng)中心處扭轉(zhuǎn)角的構(gòu)型決定了中間體

6、的選擇性，最終ManNAc的產(chǎn)物為最有利產(chǎn)物。最后通過(guò)對(duì)異頭碳自由基平均電離能的研究，不同取代基的電子效應(yīng)決定了動(dòng)力學(xué)控制和熱力學(xué)控制在產(chǎn)物選擇性中所占的比例。在有機(jī)方法學(xué)角度，本文展示了通過(guò)控制底物的扭轉(zhuǎn)角和取代基，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)自由基活性的調(diào)節(jié)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)自由基反應(yīng)路徑及立體選擇性的控制?；谖覀兊陌l(fā)現(xiàn)與技術(shù)，本文簡(jiǎn)單高效地合成了ManNAc衍生物，并將其用于酶法合成了含有非天然唾液酸的三糖分子。此分子是重要的CD22的配體，可以用于B