與順式肽鍵單元相關(guān)的甘氨酰胺及其衍生物的質(zhì)子轉(zhuǎn)移機(jī)制及相關(guān)性質(zhì)研究.pdf

1、隨著X-ray和NMR等實(shí)驗(yàn)手段分辨率的提高，含順式肽鍵單元的蛋白質(zhì)數(shù)目也隨之增加。作為一種反常的存在形式，順式肽鍵單元的出現(xiàn)總是具有功能或結(jié)構(gòu)上的特定意義，但對其存在形式和穩(wěn)定性尚無明確的認(rèn)識。此外，低壘氫鍵在酶催化中的存在性及其意義也是人們目前爭論的焦點(diǎn)問題之一。鑒于此，本論文就重點(diǎn)圍繞順式肽鍵和低壘氫鍵的相關(guān)問題，利用密度泛函方法(DFT)，系統(tǒng)考察了順式肽鍵單元模型化合物一一甘氨酰胺及其衍生物的相關(guān)性質(zhì)和低壘氫鍵在絲氨酸蛋白酶催

2、化進(jìn)程中的存在性及其意義，并取得了一些有意義的研究成果，具體如下： (1)首先，我們系統(tǒng)地考察了甘氨酰胺在氣相和液相中的構(gòu)象行為。結(jié)果表明：在氣相中，存在七種穩(wěn)定的構(gòu)象，分別對應(yīng)于三對鏡像異構(gòu)體和一個(gè)具有Cs平面對稱性的構(gòu)象(分別記作構(gòu)象Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，其中的鏡像異構(gòu)體可以進(jìn)一步通過圓二色光譜(VCD)得到證實(shí)。通過與相關(guān)實(shí)驗(yàn)和理論數(shù)據(jù)的比較，澄清了各種構(gòu)象之間的相對穩(wěn)定性，確認(rèn)了甘氨酰胺的最穩(wěn)定構(gòu)象，一的基準(zhǔn)。進(jìn)而探討了其相

3、關(guān)的光譜性質(zhì)，從而為后續(xù)研究其相關(guān)性質(zhì)建立了一個(gè)統(tǒng)如紅外光譜、拉曼光譜和核磁共振等光譜，為實(shí)驗(yàn)上各種構(gòu)象的檢測和光譜指認(rèn)提供了理論依據(jù)。在溶液中，各種構(gòu)象的相對穩(wěn)定性由氣相中的Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ>Ⅳ變?yōu)棰?Ⅱ>Ⅳ>Ⅲ，其中構(gòu)象Ⅰ仍為最穩(wěn)定構(gòu)象。相對于氣相結(jié)構(gòu)，除構(gòu)象Ⅱ中的二面角發(fā)生較大變化以外，其余構(gòu)象的結(jié)構(gòu)參數(shù)變化不大。在紅外光譜特征上，主要表現(xiàn)為紅外吸收強(qiáng)度的增加和特征譜羰基振動頻率的明顯紅移。 (2)鑒于甘氨酰胺相關(guān)性質(zhì)的缺乏，在

4、上述氣相構(gòu)象的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步系統(tǒng)考察了其酸堿性和氧化還原性。結(jié)果表明，在氣相中，甘氨酰胺中三個(gè)堿性位點(diǎn)的相對活性為：氨基N>羰基O>酰胺N；三個(gè)酸性位點(diǎn)的相對活性為：酰胺N>烴基C>氨基N。因此，甘氨酰胺在氣相中主要表現(xiàn)為氨基N堿和酰胺N酸。與去質(zhì)子化相比，在氣相中，甘氨酰胺更容易表現(xiàn)為以烴基C原子為中心的自由基。值得一提的是，計(jì)算的質(zhì)子親合勢與質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果非常吻合，充分證實(shí)了所選模型和計(jì)算方法的可靠性。在氧化過程中，失去單

5、電子后的甘氨酰胺構(gòu)象以兩個(gè)C原子之間鍵的顯著伸長為結(jié)構(gòu)特征，并從理論上預(yù)測了-NH<,2>取代-OH會使得體系更容易被氧化。計(jì)算的價(jià)鍵型電子親合勢均為負(fù)值，表明在氣相中甘氨酰胺不能使得一個(gè)額外的電子填充到其最外層未占據(jù)軌道上。而在溶液中，絕熱電子親合勢變?yōu)檎担砻鞲拾滨０纺軌虿东@額外的電子而穩(wěn)定存在，從而為實(shí)驗(yàn)上檢測到價(jià)鍵型甘氨酰胺陰離子的可能性提供了必要的理論依據(jù)。進(jìn)而在電離勢和電子親合勢的基礎(chǔ)上得到的電負(fù)性、化學(xué)勢、化學(xué)軟(硬)度

6、等化學(xué)量也大大豐富了甘氨酰胺的相關(guān)性質(zhì)。 (3)為考察水分子對順式肽鍵單元的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的影響，我們分別探討了中性和質(zhì)子化的甘氨酰胺中水分子參與的質(zhì)子轉(zhuǎn)移過程。首先我們考察了在不同活性位點(diǎn)附近區(qū)域的水分子對甘氨酰胺直接異構(gòu)化和單個(gè)水分子輔助異構(gòu)化過程的影響。研究表明，在不同的活性位，水分子起到的作用有所不同：其一是促進(jìn)質(zhì)子轉(zhuǎn)移的發(fā)生，起到了誘導(dǎo)破壞甘氨酰胺分子的作用；其二是阻止質(zhì)子轉(zhuǎn)移的發(fā)生，起到了保護(hù)甘氨酰胺分子的作用，這充分

7、體現(xiàn)了鄰近水分子對順式肽鍵單元的保護(hù)性和誘變性作用。進(jìn)而我們又系統(tǒng)考察了一個(gè)水分子、兩個(gè)水分子和三個(gè)水分子以形成水鏈的方式參與的質(zhì)子轉(zhuǎn)移過程，結(jié)果表明，以形成水鏈參與的輔助方式更有利于質(zhì)子轉(zhuǎn)移的進(jìn)行。不考慮其它因素的影響，兩個(gè)水分子參與的情況為最佳輔助方式，從而為其實(shí)驗(yàn)上的相關(guān)研究提供了必要的理論依據(jù)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)子轉(zhuǎn)移過程中的能壘高度與肽鍵單元中重原子鍵角的變化程度直接相關(guān)，即變化程度越大，需要克服的能壘越高，反之亦然。對質(zhì)子

8、化甘氨酰胺的研究表明，一方面，在兩種質(zhì)子化形式的異構(gòu)化過程中，考慮到零點(diǎn)振動能(ZPVE)校正后，質(zhì)子從羰基O位到氨基N位轉(zhuǎn)移過程中的能壘消失，表明后者的質(zhì)子化形式占有絕對的優(yōu)勢；另一方面，對于發(fā)生在順式肽鍵單元中的異構(gòu)化過程而言，在一個(gè)水分子輔助的情況下，由于存在較高的能壘使得質(zhì)子轉(zhuǎn)移仍難以發(fā)生；而在二個(gè)水或者三個(gè)水分子輔助的情況下，考慮到ZPVE校正后使得質(zhì)子從羰基O位到酰胺基N位轉(zhuǎn)移過程中的能壘同樣消失，進(jìn)一步表明在中性和酸性條件

9、下順式肽鍵單元相對其異構(gòu)體形式具有絕對的穩(wěn)定性。 (4)為考察順式肽鍵單元與鄰近的順式肽鍵單元或活性小分子之間的作用機(jī)制，我們用甲酰胺(甘氨酰胺)、甲酸(甘氨酸)和甲脒等三種類型的模型分子與甘氨酰胺形成雙氫鍵復(fù)合物來分別探討了不同(相同)順式肽鍵單元之間、活性羧酸殘基與順式肽鍵單元之間和A-T堿基對之間的雙質(zhì)子轉(zhuǎn)移機(jī)制。結(jié)果表明，在質(zhì)子轉(zhuǎn)移的過程中，由于不存在單質(zhì)子轉(zhuǎn)移的中間體，因此雙質(zhì)子轉(zhuǎn)移均以協(xié)同機(jī)理進(jìn)行。對于前兩種類型的雙

10、質(zhì)子轉(zhuǎn)移，在考慮到零點(diǎn)振動能(ZPVE)校正后，其逆向能壘全部消失，表明順式肽鍵單元不會因周圍其它順式肽鍵單元和各種羧酸基團(tuán)的存在而發(fā)生結(jié)構(gòu)上的誘變，這就從本質(zhì)上預(yù)測了順式肽鍵單元的穩(wěn)定性。對于第三種類型的雙質(zhì)子轉(zhuǎn)移，該模型能夠很好地反映出A-T堿基對之間的作用機(jī)制。從逆向能壘較低、轉(zhuǎn)移產(chǎn)物不易解離和質(zhì)子轉(zhuǎn)移過程中無中間體存在等結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了生物體中A-T堿基對的穩(wěn)定性。 (5)為系統(tǒng)考察單電子氧化對順式肽鍵單元結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響

11、，基于上述雙氫鍵結(jié)合的中性復(fù)合物，我們進(jìn)而又研究了其單電子氧化行為。結(jié)果表明，單電子氧化不僅使得雙氫鍵復(fù)合物在結(jié)構(gòu)上發(fā)生較大的變化，而且因體系的不同氧化產(chǎn)物的性質(zhì)也有所不同。對于由甲酰胺和甲酸參與的雙氫鍵復(fù)合物，單電子氧化均發(fā)生在甘氨酰胺分子片上，并且氧化產(chǎn)物具有與氧化前雙氫鍵強(qiáng)度相當(dāng)?shù)膯螝滏I的特征。而對于由甘氨酸和甲脒分子參與的雙氫鍵復(fù)合物，在具有雙氫鍵結(jié)合模式的同時(shí)伴隨著單質(zhì)子轉(zhuǎn)移的發(fā)生，從而產(chǎn)生具有“distonic”陽離子自由基

12、特征的氧化產(chǎn)物。因此，在實(shí)際的生物環(huán)境中，因鄰近活性分子的不同，單電子氧化對順式肽鍵單元造成的影響也有所不同。此外，溶劑效應(yīng)和明顯水分子的參與也有利于單電子氧化的發(fā)生。 (6)如上所述，在由甲酰胺、甲酸和甘氨酸等參與的雙質(zhì)子轉(zhuǎn)移過程中，出現(xiàn)了逆向能壘消失的現(xiàn)象，這與通常提到的低壘氫鍵的特征很相似。由于目前對低壘氫鍵是否在酶催化中具有重要作用的說法一直是眾多科學(xué)家爭論的焦點(diǎn)。因此，我們構(gòu)建了合適的模型，旨在考察低壘氫鍵在絲氨酸蛋白

13、酶催化進(jìn)程中的存在性及其意義。結(jié)果表明，在氣相中低壘氫鍵可以穩(wěn)定存在；溶劑效應(yīng)對低壘氫鍵的存在性起著重要的調(diào)控作用。對于低壘氫鍵的作用，主要表現(xiàn)為兩部分：其一是由于質(zhì)子的無能壘轉(zhuǎn)移，因此對于特定的反應(yīng)體系而言，低壘氫鍵可以對外提供部分能量，即質(zhì)子轉(zhuǎn)移前后的氫鍵作用能差；其二是作為常規(guī)氫鍵中的特殊群體，發(fā)揮著與常規(guī)氫鍵類似或者更優(yōu)的優(yōu)勢。進(jìn)一步地，利用ONIOM分層算法對催化三聚體晶體結(jié)構(gòu)的計(jì)算表明，在絲氨酸蛋白酶催化的酰基化過程中，盡管