新型毛細管液相色譜柱的研制及其相關(guān)應(yīng)用.pdf

1、毛細管液相色譜柱是微分離分析的核心，也是毛細管分析技術(shù)的瓶頸。研究新型、實用、專用的毛細管色譜柱，揭示其分離機制，且與相關(guān)技術(shù)相結(jié)合，始終是毛細管微分析的首要任務(wù)。 溶膠凝膠(sol-gel)技術(shù)是色譜分析領(lǐng)域一種靈活多變的、簡單易行的固定相制備技術(shù)。溶膠凝膠技術(shù)與包覆型復(fù)合填料制備結(jié)合，是一個全新的交叉點。傳統(tǒng)包覆型復(fù)合填料制備過程中聚合物的固載化方法通常涉及自由基引發(fā)的交聯(lián)反應(yīng)，這種方法不易控制，交聯(lián)重現(xiàn)性差。探索性地采用溶

2、膠凝膠固載化技術(shù)將氣相固定液包覆并固載在無機載體表面，制備出具有不同色譜選擇性的復(fù)合型固定相，無疑有利于拓展溶膠凝膠技術(shù)的應(yīng)用范圍和開展相關(guān)復(fù)合型色譜柱保留行為的研究。 溶膠凝膠技術(shù)與普通毛細管填充柱相結(jié)合，制備的細內(nèi)徑顆粒固定化無塞整體柱已在毛細管電色譜領(lǐng)域得到應(yīng)用。在此基礎(chǔ)上，開創(chuàng)性制備高性能大口徑無開裂顆粒固定化無塞整體柱，并將其應(yīng)用于復(fù)雜蛋白質(zhì)組學(xué)樣品的固相預(yù)富集，無論從柱制備技術(shù)還從應(yīng)用范圍，是一項創(chuàng)新性和實用性兼?zhèn)涞?/p>

3、工作。 發(fā)展高通量、高峰容量、高分辨率的新型蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺已成為當(dāng)務(wù)之急。鑒于蛋白質(zhì)組學(xué)樣品的復(fù)雜性和現(xiàn)有二維液相／串級質(zhì)譜體系有限的運行通量，建立一個新型的和實用性極強的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)平臺，無疑對蛋白質(zhì)組學(xué)多維色譜技術(shù)的發(fā)展提供了有益的支持。 本論文以溶膠凝膠技術(shù)制備毛細管色譜柱為核心，研究開發(fā)了新型實用的毛細管色譜柱，并在此基礎(chǔ)上開展相關(guān)研究和應(yīng)用工作。制備出氣相固定液包覆硅膠復(fù)合型固定相，并與線性溶劑化相關(guān)

4、能色譜理論相結(jié)合，研究其分離機理和色譜行為；制備了大口徑顆粒固定化型無塞整體柱，對其作為肽段預(yù)富集柱的性能指標(biāo)進行了測試和評價；搭建了蛋白質(zhì)組學(xué)陣列式全多維色譜分離技術(shù)平臺，將‘所制備預(yù)柱應(yīng)用其中，提高和拓展多維色譜分離技術(shù)的分離性能。 本論文共分五章。主要內(nèi)容摘要如下： 第一章總結(jié)了毛細管色譜柱的發(fā)展概況和溶膠凝膠技術(shù)在色譜固定相制備領(lǐng)域的應(yīng)用及進展，同時概述了蛋白質(zhì)組學(xué)多維色譜技術(shù)的發(fā)展及新型色譜柱與之相結(jié)合的應(yīng)用前

5、景。介紹了本論文選題的目的和意義。 第二章開創(chuàng)性地采用溶膠凝膠法制備了氣相固定液包覆硅膠復(fù)合型固定相。詳細考察研究了制備中對色譜柱性能影響的主要因素，通過優(yōu)化氣相固定液的用量、溶膠凝膠前驅(qū)體的體積濃度和柱內(nèi)反應(yīng)時間及溫度，確定了最佳包覆工藝條件，明確了用溶膠凝膠法進行聚合物包覆無機載體的可行性。以不同極性的的芳香族化合物為探針，測試評價了合成固定相的色譜性能。結(jié)果表明，所制備的復(fù)合型SE-30包覆硅膠固定相分離性能良好，柱效可達

6、10000／m，耐堿性良好，對堿性化合物的分離存在一定程度的色譜峰拖尾。疏水選擇性和絕對流動相靈敏度的檢測表明，該固定相具有反相固定相保留的特征。 第三章利用線性溶劑化相關(guān)能理論(LSERs)對不同氣相固定液(SE-30，SE-54，OV-1701)包覆硅膠固定相的反相色譜行為分別做了研究，建立了線性良好的化合物保留預(yù)測方程，并與碳十八鍵合硅膠固定相的溶質(zhì)保留行為做了比較。研究表明，氣相固定液包覆硅膠固定相與碳十八鍵合硅膠固定相

7、(ODS)在保留機理上有很大不同，溶解機理多于吸附機理。溶質(zhì)的體積，偶極性／極化率，氫鍵給體酸性和氫鍵受體堿性共同成為決定溶質(zhì)保留主要因素。另外固定液包覆硅膠固定相與溶質(zhì)之間可以發(fā)生很強的兀．兀作用，因此它對強偶極性極化率的化合物選擇性較高。由于保留機理不同，氣相固定液包覆硅膠固定相和ODS固定相對于相同的化合物將表現(xiàn)出不同的選擇性。無疑這對滿足實際樣品分析中復(fù)雜的分離要求提供了一個新的手段。另外，所制備固定相的選擇性可通過改變包覆的聚

8、合物的類型來控制，相比通常情況下反相液相色譜中只靠改變流動相配比來控制分離選擇性，無疑具有機動靈活的優(yōu)勢。 第四章用溶膠凝膠法以甲基三乙氧基硅氧烷為單一前驅(qū)體成功制備出了內(nèi)徑為320p．m和530μm的大口徑無開裂的顆粒固定化型無塞整體柱。首先對柱制備的溶膠凝膠配方和工藝條件進行了優(yōu)化，摸索出的制作工藝簡便易行，可靠性和可控性強，避免了批量裝填短柱的繁瑣和費時，提高了預(yù)柱制備重現(xiàn)性和批量生產(chǎn)可能性。其次，我們將其作為肽段預(yù)富集柱

9、應(yīng)用于多維液相色譜平臺，對預(yù)富集柱的相關(guān)性能指標(biāo)進行了測試和評價，探討了最佳富集條件。建立了在線預(yù)富集／分離檢測體系，利用六通閥將毛細管預(yù)柱與毛細管反相分離柱相連，聯(lián)用紫外檢測。結(jié)果表明，自制的320-gm-i．d．和530-ltm-i．d．的預(yù)柱機械強度高，長度5mm即可耐壓至300bar，且通透性良好。富集流速可達60μL／min，樣品負(fù)載量高達70μg，回收率90％，濃度線性回歸系數(shù)R2=0．99，富集倍數(shù)達60倍。重復(fù)使用150

10、次，重現(xiàn)性和化學(xué)穩(wěn)定性依然良好。因此自制預(yù)富集柱能夠方便快捷地實現(xiàn)肽段的除鹽和高倍濃縮，極大改善了樣品上樣量、分析靈敏度和檢測限，非常適合應(yīng)用于二維液相色譜分離技術(shù)平臺。 第五章搭建了新型陣列式二維液相色譜分離-MALDI-TOF-TOF-MS檢測技術(shù)平臺，將自制預(yù)富集柱應(yīng)用于樣品的在線預(yù)處理，對人肝組織的蛋白質(zhì)組進行了高效分離和檢測。多通道式的并行接口模式使系統(tǒng)在第二維18根反相柱上實現(xiàn)并行式洗脫，使樣品分析時間縮短18倍。該

11、平臺以強陽離子交換色譜(SCX)為第一維色譜分離模式，以反相液相色譜(RPLC)為第二維分離模式，可快速完成進樣，濃縮除鹽、分離及鑒定，實現(xiàn)真正的蛋白質(zhì)組學(xué)研究所需的高通量分析。SCX柱采用階梯式鹽梯度洗脫，洗脫下來的組分通過兩個十通閥的切換被依次保留在18個自制預(yù)富集柱的柱頭，進行樣品的濃縮和除鹽。然后經(jīng)多通道式接口被并行反沖到相應(yīng)的反相色譜柱上，在18根反相色譜柱上同時完成色譜分離。色譜流出物通過一個自行設(shè)計加工的接口實現(xiàn)并行式點樣