基于表面增強(qiáng)拉曼光譜和多元統(tǒng)計(jì)分析的肝病血清快速檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、目的：
　　肝病的早期檢測(cè)診斷對(duì)于病人的及時(shí)治療意義重大，而現(xiàn)有的檢測(cè)手段存在著檢測(cè)周期長(zhǎng)，成本較高等缺點(diǎn)，因而針對(duì)現(xiàn)有肝病早期診斷檢測(cè)手段的一些不足，通過(guò)對(duì)正常人、幾種慢性乙肝病患者（慢性乙型肝炎、慢乙肝肝硬化代償期、慢乙肝肝硬化失代償期）、肝癌四分期患者（極早期、早期、中期、晚期）和食管癌患者血清表面增強(qiáng)拉曼光譜（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）進(jìn)行研究，比較其光譜差別，并基于

2、多元統(tǒng)計(jì)分析方法分析不同類型血清差異，建立肝病診斷模型，探索一種基于SERS的肝病快速無(wú)損檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝病的早期診斷和及早防治。
　　方法：
　　通過(guò)比較金溶膠和銀溶膠對(duì)血清的拉曼信號(hào)增強(qiáng)效果，選擇一種對(duì)血清拉曼信號(hào)增強(qiáng)效果較好的納米增強(qiáng)基底。
　　基于優(yōu)化后的增強(qiáng)拉曼基底，分別對(duì)304例正常人血清、48例慢性乙型肝炎患者血清、49例慢乙肝肝硬化代償期患者血清、48例慢乙肝肝硬化失代償期患者血清、46例肝癌極早期患

3、者血清、46例肝癌早期患者血清、49例肝癌中期患者血清、47例肝癌晚期患者血清和99例食管癌患者血清進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜信號(hào)測(cè)量；對(duì)拉曼光譜進(jìn)行光譜平滑和基線扣除、歸一化處理后，對(duì)不同類型血清拉曼光譜之間差異進(jìn)行分析，并判斷其拉曼峰歸屬。
　　基于有監(jiān)督學(xué)習(xí)的正交偏最小二乘判別分析法（Orthogonalpartial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）多元統(tǒng)計(jì)分析方法，分別比

4、較了正常人、所有肝病患者及食管癌患者的血清SERS譜的差別，慢性乙肝病和肝癌患者血清SERS譜的差別，慢性乙肝肝炎和慢乙肝肝硬化代償期和失代償期患者血清SERS譜的差別，肝癌極早期與肝癌早期、肝癌中期、肝癌晚期四者血清SERS譜的差別，使用主成分得分圖、受試者工作特征曲線（Receive Operating Characteristic，ROC）對(duì)每種分類方法的模型進(jìn)行分類效能評(píng)估，使用十折交叉驗(yàn)證對(duì)模型泛化能力進(jìn)行評(píng)估，使用200次置

5、換檢驗(yàn)對(duì)觀測(cè)值和模型穩(wěn)健性進(jìn)行評(píng)估；在模型分類效果較好情況下，分析模型的變量投影重要性值（Variableimportant projection，VIP），篩選VIP＞1的拉曼位移，并對(duì)所對(duì)應(yīng)的拉曼峰的歸屬進(jìn)行查找，進(jìn)而對(duì)不同類別肝病間代謝物質(zhì)差異查找原因。
　　基于無(wú)監(jiān)督學(xué)習(xí)的主成分分組分析（Principal Component Analysis–CLASS，PCA-CLASS）的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，同樣比較了正常人、肝病患者

6、和食管癌患者，慢性乙肝病和肝癌患者，慢性乙型肝炎和慢乙肝肝硬化代償期和失代償患者、肝癌四分期患者之間的血清SERS譜差異，且在按照不同分類方法比較時(shí)，分別建立了每個(gè)分組的獨(dú)立PCA模型，保證了每個(gè)分組可以最大程度的保留樣本的原始信息，使用Coomans’plot對(duì)模型的預(yù)測(cè)分組情況進(jìn)行直觀反映，根據(jù)樣本到各個(gè)模型即坐標(biāo)軸的距離，來(lái)對(duì)樣本的分類狀況進(jìn)行大體評(píng)估，后使用ROC曲線對(duì)分類器效能進(jìn)行整體評(píng)估。對(duì)分類效果較好的模型，同樣使用十折交

7、叉驗(yàn)證的方法對(duì)模型對(duì)于未知樣本的泛化能力進(jìn)行整體評(píng)估。
　　結(jié)果：
　　銀溶膠對(duì)血清拉曼光譜的增強(qiáng)效果強(qiáng)于金溶膠4~5倍，因而本研究選用銀溶膠作為SERS增強(qiáng)基底；比較了不同分組之間的血清SERS譜差異后，其差異峰多在以下位移處：556 cm-1、638 cm-1、724 cm-1、760 cm-1、811 cm-1、853 cm-1、888 cm-1、958 cm-1、1021 cm-1、1095 cm-1、1132 cm

8、-1、1218 cm-1、1326 cm-1、1339 cm-1、1438 cm-1、1580 cm-1、1655 cm-1，其歸屬分別分：色氨酸、乳糖、乙酰輔酶A、色氨酸、L-絲氨酸，谷胱甘肽、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、D-甘露糖、酰胺Ⅲ帶、脂質(zhì)、腺嘌呤、乙酰乙酸鹽、酰胺I帶。
　　基于OPLS-DA比較正常人、肝病患者和食管癌患者血清SERS譜差異時(shí)，主成分得分圖顯示三類樣本有明顯分離趨勢(shì)，受試者工作特征曲線（ROC）圖中，各

9、分類的曲線下面積（Area Under The Curve，AUC）如下：AUC（正常人）=0.998，AUC（肝病患者）=0.997，AUC（食管癌患者）=0.997。十折交叉驗(yàn)證后，訓(xùn)練集和測(cè)試集的正確率分別為97.03％，95.33%。200次置換檢驗(yàn)結(jié)果顯示模型穩(wěn)健。VIP篩選得到12個(gè)拉曼峰在組間差異大，且差異多由氨基酸、糖類、脂質(zhì)等物質(zhì)造成?；赑CA-CLASS比較三者時(shí)，ROC曲線圖中，AUC（正常人）為1，AUC（肝病

10、）為0.651，AUC（食管癌患者）為1。對(duì)模型進(jìn)行十折交叉驗(yàn)證后，訓(xùn)練集的平均正確率為74.02%，測(cè)試集的平均正確率為57.53%。綜合比較發(fā)現(xiàn)，PCA-CLASS區(qū)分肝病患者和正常人的分類效能低于有監(jiān)督的OPLS-DA的分類效能。
　　基于OPLS-DA比較慢性乙肝和肝癌患者血清SERS譜差異，得分圖中兩類組間分離趨勢(shì)明顯，ROC曲線圖中，兩類患者的AUC值均為0.997。十折交叉驗(yàn)證后訓(xùn)練集和測(cè)試集的平均值分別為96.33

11、%和94.27%，200次置換檢驗(yàn)結(jié)果表明模型穩(wěn)健。VIP篩選后得到8個(gè)位移處的拉曼信號(hào)強(qiáng)度在兩組病人之間存在顯著性差異，這多與肝臟器官進(jìn)行的氨基酸代謝、糖代謝等代謝活動(dòng)相關(guān)?；赑CA-CLASS分析，ROC曲線圖中顯示，慢性乙肝病患者AUC為0.765，肝癌患者的AUC為0.740，十折交叉驗(yàn)證后訓(xùn)練集和測(cè)試集的平均正確率分別為96.00%和85.00%，與OPLS-DA相比，兩種方法用于臨床樣本判別分析的可行性都較高。
　　

12、基于OPLS-DA比較慢乙肝和肝硬化代償期和失代償期之間差別，三類患者的主成分得分值在得分圖上往三個(gè)方向延伸，分類趨勢(shì)明顯，ROC曲線圖中，三者的曲線下面積分別為0.993，0.997，0.972。經(jīng)十次交叉驗(yàn)證后，訓(xùn)練集和測(cè)試集的平均正確率分別為91.00%和87.00%；置換檢驗(yàn)結(jié)果表明模型穩(wěn)定；VIP篩選了14個(gè)拉曼位移在組間具有顯著差異，其中，肝硬化不同階段的谷胱甘肽、脂質(zhì)和酪氨酸等物質(zhì)含量存在差異；基于PCA-CLASS方法，

13、三類患者的工作特征曲線下面積分別為0.837，0.933，0.954，十折交叉驗(yàn)證后訓(xùn)練集和測(cè)試集的正確率為87.81%和67.00%。
　　基于OPLS-DA比較肝癌四分期之間血清SERS譜差異，得分圖顯示四分期樣本有往四方向分離趨勢(shì)，但中間仍有交叉重疊，繪制的ROC曲線圖中，肝癌四分期曲線下面積分別為0.996，0.998，0.989，0.992。在進(jìn)行十次交叉驗(yàn)證后，訓(xùn)練集和測(cè)試集的平均正確率為88.77%，81.76%；2

14、00次置換檢驗(yàn)回歸線截距正常，表明模型穩(wěn)健。依據(jù)VIP值，篩選出有效位移值有13個(gè)，這些物質(zhì)在機(jī)體的生物轉(zhuǎn)化、監(jiān)視免疫過(guò)程、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝等一系列的生化反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用?；跓o(wú)監(jiān)督的PCA-CLASS算法，繪制ROC曲線后，AUC(stage0)=0.857，AUC(stage1)=0.756，AUC(stage2)=0.809，AUC(stage3)=0.940，訓(xùn)練集和測(cè)試集正確率為78.71%和54.85%，表明

15、 PCA模型相比OPLS-DA模型，其泛化能力一般。
　　結(jié)論：
　　基于SERS并結(jié)合OPLS-DA和PCA-CLASS兩種多元統(tǒng)計(jì)分析方法的血清檢測(cè)方法，對(duì)幾種肝病的判別分類有較高正確率，且檢測(cè)快速靈敏。綜合各指標(biāo)比較OPLS-DA與PCA-CLASS兩種方法，有監(jiān)督的OPLS-DA對(duì)各疾病的分類效果較好，且模型對(duì)未知樣本的泛化能力較強(qiáng)，后期可同時(shí)參照兩種分析方法，綜合對(duì)樣本進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。初步研究表明，本文建立的這種基于