蛋白質(zhì)組研究中多維液相色譜—質(zhì)譜技術(shù)平臺的建立及其應用.pdf

1、蛋白質(zhì)組學研究中高通量、高靈敏度和自動化技術(shù)平臺的建立一直是該領(lǐng)域中的難點和重點，也是目前的熱點領(lǐng)域之一。這不僅給我們提出了巨大的挑戰(zhàn)，同時也給我們進行方法學研究提供了良好的機遇。特別是作為人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃主席國單位，不僅要領(lǐng)導全世界同行進行科研攻關(guān)，為推動該計劃的發(fā)展做出我們應有的貢獻，同時還負有攻克肝病，振興國家和民族的重大歷史責任，這就要求我們要在方法上不斷進行創(chuàng)新，克服現(xiàn)有方法上的缺陷，建立一個可靠實用的方法體系，滿足蛋白質(zhì)

2、組學研究的需要，為此我們在蛋白質(zhì)組研究中多維液相色譜—質(zhì)譜技術(shù)平臺的建立方面進行了有益的探索。 毛細管色譜柱是實現(xiàn)復雜體系蛋白質(zhì)高效分離的關(guān)鍵部件之一，但是商品化的毛細管色譜柱價格昂貴，且存在各種各樣的問題，不能滿足高通量蛋白質(zhì)組研究的需要。本實驗建立的毛細管色譜柱篩板制備和裝填新方法是一種用于毛細管色譜柱篩板制備和裝填的簡單、快速、高效、成本低并且易于實施的專用方法。該方法可以選擇各種規(guī)格的毛細管、各種色譜介質(zhì)，易于實施和操

3、作，適合于裝填應用于小分子、生物大分子和多肽等的色譜分離或電色譜分離的各種模式和規(guī)格的毛細管色譜柱。該方法已經(jīng)申請國家發(fā)明專利，專利申請?zhí)枺?3121042.2。 在蛋白質(zhì)組學研究中，多肽混合物的有效分離對蛋白質(zhì)鑒定和蛋白質(zhì)之間相互作用的研究起著決定性的作用，但是對復雜的多肽混合物在反相液相色譜中保留行為的研究報道不多?；诖?，用反相液相色譜研究了不同長度的色譜柱分離多肽混合物時色譜柱長度對峰容量以及對檢測靈敏度的影響，同時考

4、察了梯度時間對峰容量和峰寬的影響。通過實驗發(fā)現(xiàn)色譜柱長對峰容量和靈敏度有顯著影響，而延長梯度時間雖然可以增加峰容量，但會增加峰寬，盡管如此卻對質(zhì)譜鑒定有利。說明對蛋白質(zhì)組學研究中用毛細管液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法對多肽混合物進行分離鑒定時，采用更長的色譜柱和更長的梯度洗脫時間有利于對更多的多肽進行分析。 嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(SARS)給我國人民的生命安全和社會穩(wěn)定造成巨大威脅，為了探索其發(fā)病機理，研制診斷試劑，開發(fā)預防疫苗

5、和治療藥物，我們用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對SARS冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)進行了研究，鑒定出了N、S和M三種SARS結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，并準確測定了N蛋白質(zhì)的分子量。由分子量測定結(jié)果和生物信息學推斷的N蛋白質(zhì)的理論分子量比較可以確定N蛋白質(zhì)不存在常見的磷酸化修飾和糖基化修飾或含量很低。進一步的研究表明N蛋白質(zhì)可能存在降解現(xiàn)象，其降解機理尚需探索。另外，提出了一種適合組成比較簡單生物樣品蛋白質(zhì)組研究新技術(shù)方法，即首先對蛋白質(zhì)混合物進行分離，然后再進行酶

6、切和毛細管反相分離-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，可以有效提高蛋白質(zhì)鑒定的覆蓋效率。 人肝臟是人體內(nèi)復雜性僅次于腦的最大器官，在人體的生命活動中占有十分重要的地位，而4～6月孕齡的人胎肝還是造血、免疫系統(tǒng)干祖細胞的主要來源，因此，對胎肝蛋白質(zhì)組進行研究既具有重要的學術(shù)意義，也具有實用價值。本研究首次提出了在離子交換色譜中采用雙梯度洗脫模式并將其用于整體蛋白質(zhì)預分離過程。同時提出兩維色譜預分離—一維反相毛細管液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用的鑒定方法，為蛋白