轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的新型多聚物載藥納米粒的研制及靶向逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥的體外研究.pdf

1、目的：為了增加抗腫瘤藥物的主動(dòng)靶向性，降低藥物毒副作用，同時(shí)克服白血病的多藥耐藥(MDR)，我們研制了一種既能特異性定位于腫瘤細(xì)胞膜受體又能阻止藥物外排的新型多聚物載藥納米粒——轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)修飾的共載化療藥物柔紅霉素(DNR)和中藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑漢防己甲素(Tet)的聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸-聚乙二醇(PLGA-PLL-PEG)多聚物納米粒DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf。
　　方法：合成PLGA-PLL-PEG多聚

2、物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，以單載DNR的多聚物納米粒DNR-PLGA-PLL-PEG為先行試驗(yàn)基礎(chǔ)，摸索合成工藝，進(jìn)一步制備共載DNR及Tet的多聚物納米粒DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG，最后共價(jià)連接腫瘤細(xì)胞膜表面高表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)的靶向配體Tf,形成靶向腫瘤細(xì)胞的載藥多聚物納米粒DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf及DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf。通過(guò)核磁共振氫譜、激光粒度儀、高效液相色譜儀、凝膠滲透色

3、譜、高分辨掃描電鏡等對(duì)制備的納米粒進(jìn)行物理表征，通過(guò)體外透析試驗(yàn)了解載藥納米粒的釋藥特性，采用藥物抑制試驗(yàn)評(píng)估空白納米粒的安全性以及載藥納米粒在體外對(duì)人白血病敏感細(xì)胞株K562細(xì)胞和耐藥細(xì)胞株K562/ADR細(xì)胞的抑制作用，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞內(nèi)DNR的含量，熒光顯微鏡觀察柔紅霉素在細(xì)胞內(nèi)的分布，qRT-PCR和Western blotting分析TfR基因和蛋白、mdrl/P-gp以及凋亡相關(guān)基因和蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

4、>　　結(jié)果：1、成功合成的PLGA-PLL-PEG多聚物產(chǎn)率較高(61±14％)、結(jié)構(gòu)明確。以其作為載體制備的靶向載藥多聚物納米粒DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf和DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf,掃描電鏡下呈球形或近似球形，粒徑分別為229±19 nm和213±12 nm，Zeta電位分別為-18.74±0.28 mV和-19.16±0.31 mV。DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf的DNR載藥量為5.21±0

5、.11％，Tf含量為2.43±0.26％;DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf的載藥量分別為DNR3.63±0.15％和Tet4.27％±0.12％，Tf含量為2.18％±0.11％。Tf偶聯(lián)反應(yīng)前后藥物含量測(cè)定結(jié)果顯示:反應(yīng)過(guò)程中納米載體所攜載的藥物穩(wěn)定，沒(méi)有泄漏現(xiàn)象。體外釋放實(shí)驗(yàn)顯示:DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf、DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf的藥物釋放呈雙相性模式，在最初8h存在突釋現(xiàn)象，分別釋

6、放出52.93±3.76％的DNR，50.47±3.74％的DNR和47.86±2.42％的Tet，此后呈現(xiàn)良好的緩釋特征，釋放時(shí)間超過(guò)一周。
　　2、對(duì)于敏感細(xì)胞株K562細(xì)胞，靶向載藥納米粒DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf和DNR的抑制作用均隨著濃度的增加而增強(qiáng)，DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf的IC50值低于DNR(0.91±0.10μg/ml vs1.31±0.24μg/ml)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DNR-PLG

7、A-PLL-PEG-Tf和DNR對(duì)K562細(xì)胞的凋亡率分別為50.24±3.40％和40.78±1.10％，顯著高于Con組(P＜0.05)，DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力較DNR強(qiáng)(P＜0.05)。DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf和 DNR處理K562細(xì)胞后，細(xì)胞胞漿胞核均可見較多的DNR分布及明顯細(xì)胞凋亡的特征性改變，如核固縮、核碎裂、核溶解。DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf能顯著上調(diào)K562細(xì)

8、胞tfr基因的轉(zhuǎn)錄及TfR蛋白表達(dá)(P＜0.05)。
　　3、對(duì)于耐藥細(xì)胞株K562/ADR細(xì)胞，無(wú)論DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf或是DNR和Tet的混合水溶液(DNR/Tet)的抑制作用亦均隨著濃度的增加而增強(qiáng)，DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf的IC50值(為DNR和Tet的總藥量之和)低于DNR/Tet(0.87±0.01μg/ml vs1.47±0.15μg/ml)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

9、　　加入耐藥逆轉(zhuǎn)劑Tet后，DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf較DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf能顯著增加細(xì)胞凋亡率(58.21±2.71％ vs8.84±0.24％)及細(xì)胞內(nèi)DNR濃度(RFI:37.96±0.42 vs16.37±0.64)(P＜0.05)。與DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG相比，載體經(jīng)Tf修飾后，DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf更能增加細(xì)胞凋亡率(58.21±2.71％ vs

10、33.41±3.03％)及細(xì)胞內(nèi)DNR濃度(RFI:37.96±0.42 vs27.19±1.17)(P＜0.05)。
　　DNR-PLGA-PLL-PEG組、DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf組和DNR組中DNR主要分布于細(xì)胞漿，DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG組、DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf組和DNR/Tet組中DNR主要分布在細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)。DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG、DNR/T

11、et-PLGA-PLL-PEG-Tf、DNR/Tet組細(xì)胞中均可見到細(xì)胞凋亡的特征性改變，如核固縮、核碎裂、核溶解。
　　DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf能顯著上調(diào)K562/ADR細(xì)胞tfr基因的轉(zhuǎn)錄和TfR蛋白表達(dá)(P＜0.05);下調(diào)K562/ADR細(xì)胞mdrl mRNA的轉(zhuǎn)錄和P-gp的表達(dá)(P＜0.05);上調(diào)Caspase3和Bax的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)(P＜0.05)，下調(diào)Bcl-2、Survivin和NF

12、-κB的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)(P＜0.05)。
　　結(jié)論：1、合成的多聚物納米粒PLGA-PLL-PEG可攜載多種藥物，末端經(jīng)Tf修飾，可形成具有主動(dòng)靶向性能的納米載體PLGA-PLL-PEG-Tf,粒徑均一并具有緩釋特點(diǎn)。
　　2、單載柔紅霉素的靶向載藥納米粒DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf對(duì)人白血病敏感細(xì)胞株K562細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒性，可能通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿內(nèi)，并緩慢釋放藥物進(jìn)入細(xì)胞核從而誘導(dǎo)凋亡。同

13、時(shí)可能通過(guò)上調(diào)細(xì)胞表面tfr的基因轉(zhuǎn)錄和TfR蛋白表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)TfR介導(dǎo)的藥物內(nèi)吞作用。
　　3、共載柔紅霉素和漢防己甲素的靶向載藥納米粒DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf在體外對(duì)人白血病耐藥株K562/ADR細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制作用，可通過(guò)下調(diào)細(xì)胞mdrl/P-gp表達(dá)減少DNR的外排作用增加藥物蓄積，上調(diào)Bax/Bcl-2比值和Caspase3的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)、下調(diào)Survivin和NF-κB的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)