急性髓性白血病多藥耐藥基因芯片的構(gòu)建.pdf

1、急性髓細胞白血病(AcuteMyelogenousLeukemia，AML)治療的主要手段是化療，而臨床上多藥耐藥(Multidrugresistance，MDR)已成為化療失敗的主要原因。目前嘗試逆轉(zhuǎn)MDR的結(jié)果尚不理想，因此盡早準確預測MDR的發(fā)生，及時指導臨床調(diào)整治療是MDR研究的主要目的之一。 MDR是多因素多機制共同作用的結(jié)果，目前公認的主要機制之一是耐藥相關(guān)基因的異常表達。例如，MDR1(multidrugresis

2、tancegene1)基因編碼PgP(P-glycoprotein，P糖蛋白)，與化療效果相關(guān)，可作為AML等血液腫瘤預測復發(fā)和預后，評估逆轉(zhuǎn)MDR策略的重要指標。多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrugresistance-associatedprotein,MRP)基因也具有賦予MDR表型的能力，和Pgp的耐藥機制有所不同；MRP單獨表達對化療效果和預后的影響還不十分明確，但MRP基因和其它耐藥基因聯(lián)合表達對AML的療效和預后則是一個很

3、強的不良信號。肺耐藥相關(guān)蛋白(Lungresistanceprotein，LRP)可能通過核靶點屏蔽等機制引起MDR，其基因表達水平與腫瘤細胞化療耐藥有關(guān)，有研究表明LRP在AML中也是一個影響化療敏感性和預后的獨立因子，在體外預測MDR比PgP和MRP都要好。乳腺癌耐藥蛋白(breastcancerresistanceprotein，BCRP)基因過度表達可導致臨床化療耐藥，是AML患者預后的重要不良因素。B細胞淋巴瘤白血病基因2(B

4、-celllymphoma-leukemia-2gene，Bcl-2)是凋亡抑制基因，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，其高表達與許多抗白血病藥物的耐藥和臨床白血病難治、復發(fā)有關(guān)，越來越受到學者們的重視。 對MDR相關(guān)基因mRNA表達或其表達蛋白的檢測，目前主要有原位雜交、免疫組化、RT-PCR等方法，但仍存在特異性和敏感性方面的問題，且一般只能粗略反映某一基因的表達水平。免疫細胞化學結(jié)合流式細胞儀的方法近年來為國內(nèi)外研究人員所推薦

5、，但難于適應同時進行多通道大樣本量的臨床實踐檢測需要。 使用基因芯片可以解決上面提到的難題?；蛐酒?Genechip)的檢測原理為將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列于支持物上，每平方厘米內(nèi)可排列近千個點。然后與待測的標記樣品的基因按堿基配對原理進行雜交，再通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，并配以計算機系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號作出比較和檢測，從而迅速得出所要的信息。由于基因芯片可以包含的信息非常

6、多，可以集中多達幾千種探針信息，而目前發(fā)現(xiàn)的耐藥相關(guān)基因有限，所以基因芯片能夠輕松地完成基因檢測任務。我們構(gòu)建的AML多藥耐藥基因芯片技術(shù)平臺，利用多種探針對AML多藥耐藥相關(guān)基因的表達進行快速而準確的檢測。 首先我們建立成功了多重逆轉(zhuǎn)錄和半巢式PCR的方法檢測耐藥細胞株HL60/VCR中的多種耐藥基因表達，此方法為基因芯片的制備、條件優(yōu)化和結(jié)果驗證奠定了基礎(chǔ)。然后開始了基因芯片的設計。DNA芯片的制備方法主要有兩種：一種是在直

7、接在固定面上原位化學合成一系列寡核苷酸，另一種將預先合成好的不同寡核苷酸按照一定的排列方式點樣，固定在固相面上。前一種有嚴格的專利保護，我們采用的是后者。本實驗用生物學軟件Oligo6.0和primerpremier5.0，以及在線NCBIBLAST程序輔助，篩選了多種MDR基因和內(nèi)參照基因片斷的特異性探針，制備成基因芯片，通過醛基化手臂分子固定等化學處理后即可進行雜交反應。再從經(jīng)建立的逆轉(zhuǎn)錄半巢式多重PCR驗證過的耐藥細胞模型HL60

8、/VCR、臨床難治性AML患者骨髓、化療敏感的AML患者骨髓等樣本中抽提總RNA，以熒光Cy3標記5'端的隨機六聚體引物摻入的方式，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后與芯片雜交，然后利用激光共聚集顯微掃描技術(shù)判定雜交結(jié)果，進行數(shù)據(jù)分析。在實驗過程中，對芯片制備條件和雜交反應的各項參數(shù)進行了探討和優(yōu)化。 利用基因芯片檢測多藥耐藥基因表達是一個復雜的過程，受許多因素影響。在摸索AML多藥耐藥芯片制備和雜交條件中，我們發(fā)現(xiàn)探針的設計制備和雜交反應是最

9、關(guān)鍵的，主要包括以下幾個方面的影響： 1.雜交序列長度的影響。由于芯片檢測的機理是基于Watson-Crick配對規(guī)則，完全配對的雙鏈要比存在錯配堿基的雙鏈分子具有較高的熱力學穩(wěn)定性，因此，產(chǎn)生的熒光信號強度要高5-10倍，一般來講，短的雜交序列更容易區(qū)分堿基的錯配，但穩(wěn)定性差一些。我們在實驗過程中采用加10個T臂后45個左右堿基的寡核昔酸探針，取得了較好結(jié)果。 2.雜交序列中G+C含量的影響：在基因芯片檢測中，序列組成

10、是最不確定的參數(shù)，從理論上講，富含G+C的區(qū)域雜交穩(wěn)定性較好。考慮到在一次基因芯片檢測中將會形成幾十個，甚至成百上千個異源雜交物，所以有必要篩選出最佳的反應條件。由于G+C含量直接決定著Tm值和雜交反應的溫度，因此，在設計檢測探針時非常重視G+C含量，盡量做到各個探針的Tm相差在2度以內(nèi)。 3.探針濃度：探針溶在3×SSC探針緩沖液中，在設定的52℃下雜交1小時，如果探針是用手點的，則40pM的探針濃度雜交效果好，濃度偏高后信號

11、強度急劇下降甚至消失。如果探針是用點樣儀點的，則50-80pM的探針濃度雜交效果較好。 4.雜交溫度和雜交時間對雜交結(jié)果的影響：雜交溫度和雜交時間是二個比較重要的指標，而且它們之間具有一定的聯(lián)系，一般雜交溫度高的時候，需要較短的雜交時間，而雜交溫度低的時候，雜交時間需要延長。而且片段的長度與雜交時間成正比，雜交片段越長，所需的雜交時間也越長，甚至有的需要雜交過夜，但時間過長可能會加深非特異性背景。我們摸索的條件是，在52℃下，進

12、行1小時的雜交，掃描結(jié)果顯示雜交信號強，而且特異性也較好。 實驗結(jié)果表明，構(gòu)建的基因芯片能同時檢測出耐藥細胞模型中多種耐藥基因表達，未見有非特異性的交叉反應。對臨床標本進行了初步的檢測，亦顯示了較好的特異性和敏感性。在檢測中還發(fā)現(xiàn)，臨床耐藥和難治性AML患者多為多種耐藥基因聯(lián)合表達，而化療敏感患者不表達或者僅表達單一耐藥基因。至于不同組合的耐藥基因表達和臨床化療效果的關(guān)系，則需要在更大樣本量檢測時進一步研究和統(tǒng)計確定，同時也更應