基于磁性材料固定酶的微波酶解新技術(shù).pdf

1、本文研究了以功能磁性納米材料固定酶為基礎(chǔ)的微波輔助快速酶解新方法。發(fā)展了一系列新的在納米磁性微球表面固定酶的簡便方法,并利用納米磁球能高效吸收微波輻射能量的優(yōu)點(diǎn),將蛋白酶固定在合成好的納米微球上,在微波輻射下,極大的提高了蛋白酶解的效率。相比于傳統(tǒng)的溶液酶解方法,該酶解技術(shù)將蛋白酶解所需時間從12小時縮短至15秒,而且酶解效果優(yōu)于傳統(tǒng)的溶液酶解方法。在微波輻射的幫助下,甚至連微克級的蛋白也能被有效酶解并鑒定。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的實(shí)用性

2、,復(fù)雜生物樣品----鼠肝全蛋白提取物用該方法在15秒內(nèi)進(jìn)行了酶解也顯示了非常好的效果。此外,利用一個外加磁鐵,固定在磁球上的酶還能被回收利用。本研究分為四個部分：
　　 第一章介紹了選題的背景、意義。介紹了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和酶解在這一蓬勃發(fā)展領(lǐng)域的重要性和最新技術(shù)進(jìn)展。進(jìn)而提出,以固定酶為基礎(chǔ)的酶解技術(shù)已經(jīng)成為了一個快速或在線酶解的趨勢,而微波輔助酶解則因?yàn)槠浜啽阌行У牟僮餍远艿皆絹碓蕉嗟娜说年P(guān)注。二者的結(jié)合鮮有報道,也

3、僅局限于標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
　　 第二章研究了以四氧化三鐵磁球固定酶為基礎(chǔ)的微波輔助酶解技術(shù)。以γ-縮水甘油醚基丙基三甲氧基硅烷(GLYMO)為偶聯(lián)劑,只需一步反應(yīng)就可以將胰蛋白酶固定在磁球上。且四氧化三鐵磁球合成簡單,磁響應(yīng)性良好。將這一固定酶與微波輔助酶解技術(shù)相結(jié)合,所產(chǎn)生肽段用MALDI-TOF MS進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示極短時間內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)蛋白就得到了的有效酶解。然后考察不同條件下酶解的完全性和效率。最后將這一微波酶解方法應(yīng)用到“Top-

4、Down”技術(shù)路線中,酶解了鼠肝蛋白提取物的反相分離流份。質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示這一方法對實(shí)際樣品表現(xiàn)出了極好的可行性。
　　 第三章考慮到四氧化三鐵磁球表面活性羥基基團(tuán)少從而導(dǎo)致酶負(fù)載量較低的問題,改進(jìn)了磁性載體。發(fā)展了先在四氧化三鐵磁球表面包覆硅層,然后再在磁性硅球表面鍵合GLYMO的方法。通過測定發(fā)現(xiàn)酶的負(fù)載量提高了3-4倍。類似的用磁性硅球微波酶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白,優(yōu)化反應(yīng)條件。然后將這一優(yōu)化之后的條件應(yīng)用到未經(jīng)過任何預(yù)分離的鼠肝全蛋

5、白。15秒的微波酶解之后,直接進(jìn)行LC-ESI-MS/MS分析。整個分析過程只有1個小時,在99％可信度下鑒定了318個蛋白,達(dá)到了與傳統(tǒng)溶液酶解方法相當(dāng)?shù)男Ч?但時效性大大增強(qiáng)。這一結(jié)果證明了磁性材料微波酶解技術(shù)的巨大潛力,它大大增進(jìn)了蛋白質(zhì)組學(xué)的通量性,并且展示了其在臨床診斷應(yīng)用上的前景。
　　 第四章發(fā)展了另一種氨基納米磁球固定酶的方法,該氨基納米磁球合成工藝簡單,比表面積大,進(jìn)一步提高了固定酶的量,且克服了磁性硅球合成工