微波輔助酶解技術(shù)在蛋白及多肽研究中的應(yīng)用.pdf

1、微波輔助酶解技術(shù)作為一種高效快速的蛋白酶解技術(shù)，具有作用時(shí)間短，酶解速度快、酶解產(chǎn)物可控等特點(diǎn)，近年來(lái)被應(yīng)用于蛋白組學(xué)分析及多肽分離與分析中。微波輔助酶解技術(shù)主要包括自由酶酶解以及微波輔助固定化酶酶解等，自由酶酶解由于酶活相對(duì)較高而成為主要研究手段。而固定化酶技術(shù)具有酶與產(chǎn)物易分離的特點(diǎn)。本文采用微波輔助自由酶以及固定化酶技術(shù)，以廣西特色資源食材銀杏蛋白和野生黑螞蟻蛋白為原料研究?jī)煞N蛋白的快速與定向酶解，對(duì)微波輔助自由酶酶解以及基于磁性

2、材料固定化酶酶解技術(shù)進(jìn)行了研究并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 (1)對(duì)微波輔助自由酶酶解螞蟻蛋白進(jìn)行了研究。幾種蛋白酶的優(yōu)化結(jié)果表明木瓜蛋白酶對(duì)螞蟻蛋白具有較好的酶解效果。在溫度50℃、底物濃度0.02g/mL、酶解時(shí)間60 min、給酶量5500 u/g的條件下，在功率為300 W的微波作用下，螞蟻蛋白酶解率能夠達(dá)到62.40％，優(yōu)于常規(guī)水浴酶解6h的蛋白酶解率(50.83%)。對(duì)酶解液的總抗氧化性以及DPP

3、H自由基清除實(shí)驗(yàn)表明，酶解過(guò)程產(chǎn)生的多肽混合液具有一定的活性。凝膠電泳法表明酶解產(chǎn)物的分子量分布主要在14.4KDa以下。HPLC分析表明：在微波輔助作用下，木瓜蛋白酶可以較好地對(duì)螞蟻蛋白進(jìn)行酶解，可產(chǎn)生豐富的多肽片段。
　　 (2)研究了微波輔助下化學(xué)共沉淀合成Fe3O4磁性粒子，并以Fe3O4磁性材料為載體研究木瓜蛋白酶的固定化。對(duì)戊二醛的濃度、給酶量以及固定化時(shí)間等固定化條件的優(yōu)化研究表明，戊二醛濃度為3.75%、給酶量為

4、0.4 mg/mL、固定化時(shí)間為4h時(shí)獲得的固定化酶效果最佳，酶的固定化效率達(dá)52.03%。在微波輔助的條件下對(duì)螞蟻蛋白進(jìn)行酶解(50℃，60 min)，酶解率達(dá)31.75%。對(duì)固定化酶和自由酶的酶解率、酶解液的抗氧化活性和DPPH自由基清除能力的對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明，固定化木瓜蛋白酶能夠用于螞蟻蛋白的酶解，SDS-PAGE和HPLC對(duì)酶解物的對(duì)比分析表明，酶解液中多肽片段的差異導(dǎo)致了酶解液生物活性的差異。
　　 (3)在微波作用下，分