HPA1-28w基因分型方法的研究和血小板供者基因庫(kù)的建立及應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　建立血小板同種抗原（HPA1-28w）系統(tǒng)測(cè)序分型技術(shù)(PCR-SBT)基因診斷方法，并建立無(wú)償獻(xiàn)血者血小板HPA、HLA-A、B基因數(shù)據(jù)庫(kù)，評(píng)估HPA1-28w系統(tǒng)錯(cuò)配的概率。利用建立的血小板基因型數(shù)據(jù)庫(kù)，為血小板輸注無(wú)效患者選擇基因“數(shù)字化”配合的供者，為有效解決血小板輸注無(wú)效提供一種可行的方法，進(jìn)一步提高臨床輸血安全。
　　方法：
　　1.采用商用基因組DNA抽提試劑盒，利用自動(dòng)抽提設(shè)備對(duì)樣本基因組D

2、NA進(jìn)行抽提。樣本來(lái)自隨機(jī)的1060例單采血小板獻(xiàn)血者，征其知情同意后采集全血標(biāo)本。
　　2.從歐洲免疫多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)(the Immuno Polymorphism Database，IPD：www.ebi.ac.uk/ipd/hpa)中下載HPA1-28w所在基因的核酸序列信息及各HPA相關(guān)的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，利用Primer3.0(v.0.4.0)軟件設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化PCR參數(shù)，實(shí)現(xiàn)同一擴(kuò)增條件下擴(kuò)增HPA1-28w系統(tǒng)。然后采

3、用商用試劑（ABI Bigdye3.1）參照試劑說(shuō)明進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，利用ABI SeqScape V2.5軟件進(jìn)行HPA序列比對(duì)分析。
　　3.采用商用試劑進(jìn)行HLA-A,B位點(diǎn)基因分型，參照試劑說(shuō)明進(jìn)行操作。采用Assign3.5 SBT分析軟件確定標(biāo)本HLA等位基因，HLA-A,B位點(diǎn)等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算，單體型頻率及 Hardy–Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)均采用Arlequin軟件分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)

4、學(xué)意義。
　　4.采用單克隆抗體特異的血小板抗原固定試驗(yàn)（MAIPA）方法檢測(cè)PTR患者HPA抗體和HLA抗體。按照交叉反應(yīng)組（CREGs）配合技術(shù)在血小板供者數(shù)據(jù)庫(kù)選擇供者，配型分級(jí)按照美國(guó)AABB血小板HLA配型分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。
　　5.HPA等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算，Hardy–Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)采用SPSS13.0軟件，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HPA抗原不配合概率的計(jì)算公式為a抗原不配合概率=b

5、2(1-b2)，b抗原不配合概率=a2(1-a2)；HPA抗原隨機(jī)輸注不配合概率=a2(1-a2)+b2(1-b2)。
　　結(jié)果：
　　1.建立了HPA1-28w系統(tǒng)的PCR-SBT基因分型方法，所有HPA系統(tǒng)在同一條件下實(shí)現(xiàn)多重PCR擴(kuò)增。多重PCR擴(kuò)增后每組均能得到明顯的三個(gè)條帶，且三個(gè)條帶均呈現(xiàn)一定的強(qiáng)度，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度在272bp到695bp之間，與預(yù)期大小一致。除HPA-5系統(tǒng)反向引物測(cè)序時(shí)會(huì)出現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)后續(xù)堿

6、基峰雜亂外，其他HPA抗原系統(tǒng)正反兩向引物測(cè)序均得到明顯清楚的結(jié)果。檢測(cè)國(guó)際輸血協(xié)會(huì)血小板免疫學(xué)Workshop的10份考核樣本，分型結(jié)果與提供的參考結(jié)果完全一致。
　　2.在檢測(cè)的1060例樣本中，HPA-1、2、3、4、5、6w、15、21w系統(tǒng)存在多態(tài)性，其他HPA系統(tǒng)只檢測(cè)出HPA-aa基因型。其中HPA-1系統(tǒng)a頻率為0.9948，b頻率為0.0052；HPA-2系統(tǒng)a頻率為0.9410，b頻率為0.0590；HPA-3

7、系統(tǒng)a頻率為0.5316，b頻率為0.4684；HPA-4系統(tǒng)a頻率為0.9981，b頻率為0.0019；HPA-5系統(tǒng)a頻率為0.9882，b頻率為0.0118；HPA-6w系統(tǒng)a頻率為0.9835，b頻率為0.0165；HPA-15系統(tǒng)a頻率為0.5330，b頻率為0.4670；HPA-21w系統(tǒng)a頻率為0.9915，b頻率為0.0085。
　　3.HPA-1、2、3、4、5、6w、15、21w系統(tǒng)錯(cuò)配的概率分別為0.0102

8、7，0.10481，0.37400，0.00376，0.02304，0.03195，0.37391，0.01670。在不考慮ABO血型的情況，理論上出現(xiàn)一個(gè)HPA-1系統(tǒng)bb純合子，需要37144例供者。出現(xiàn)一個(gè)HPA-4系統(tǒng)bb純合子，需要280900例供者。出現(xiàn)一個(gè)HPA-5系統(tǒng)bb純合子，需要7191例供者。出現(xiàn)一個(gè)HPA-6w系統(tǒng)bb純合子，需要3669例供者。出現(xiàn)一個(gè)HPA-21w系統(tǒng)bb純合子，需要13872例供者。

9、　　4.分析顯示1060例樣本中HLA-A,B位點(diǎn)分布符合Hardy-Weinberg平衡分析。HLA-A觀察雜合度為0.87736，預(yù)期雜合度為0.88486，P值為0.14095；HLA-B觀察雜合度為0.93774，預(yù)期雜合度為0.94668，P值為0.22917。HLA-A等位基因頻率最高為A*11:01，大于1％的等位基因有A*24:02、A*02:01、A*02:07、A*33:03、A*26:01、A*02:03、A*02

10、:06、A*03:01、A*11:02、A*31:01、A*30:01、A*01:01，累計(jì)頻率達(dá)到95.85%。HLA-B等位基因頻率最高為B*46:01，大于1%的等位基因有B*40:01、B*58:01、B*07:02、B*13:01、B*13:02、B*15:01、B*15:02、B*15:11、B*39:01、B*40:02、B*40:06、B*15:18、B*48:01、B*44:03、B*51:01、B*27:04、B*3

11、5:01、B*37:01、B*38:02、B*55:02、B*54:01、B*52:01、B*15:27，累計(jì)頻率達(dá)到89.48%。
　　5.按照HLA抗原交叉反應(yīng)組進(jìn)行分類：1C組為38.0660%；2C組為57.1699%；4C組為53.2075%；5C組為40.4719%；6C為49.9527%；7C為41.5565%；8C組為7.4527%；10C組為13.5378%；12C組為30.1414%。按照B1X配合度，估算患者

12、（8C組患者）至少搜尋到1個(gè)B1X配合級(jí)供者時(shí)，理論上需要32414個(gè)供者。
　　6.用MAIPA方法分析32例血小板輸注無(wú)效標(biāo)本，其中26例檢測(cè)出HLA抗體，1例同時(shí)檢出HLA抗體和抗HPA-15抗體。對(duì)9例申請(qǐng)數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋血小板供者的PTR患者利用基因“數(shù)字化”數(shù)據(jù)配合技術(shù)進(jìn)行血小板供者篩選，其中4例篩選到A級(jí)匹配供者、2例篩選到B1U級(jí)供者、2例篩選到B1X級(jí)供者，篩選的血小板輸注后臨床癥狀改善明顯，止血效果良好。
　　

13、結(jié)論：
　　1.建立了同一擴(kuò)增體系條件下血小板同種抗原系統(tǒng)HPA1-28w基因測(cè)序診斷技術(shù)，方法準(zhǔn)確有效。
　　2.建立了1060例浙江漢族已知基因型的血小板供者數(shù)據(jù)庫(kù)。
　　3.發(fā)現(xiàn)人群中HPA-1、2、3、4、5、6w、15、21w系統(tǒng)存在多態(tài)性，其他系統(tǒng)呈現(xiàn)單一型，首次獲取了人群HPA22w-28w等位基因頻率,評(píng)估了HPA1-28w系統(tǒng)隨機(jī)輸注時(shí)抗原錯(cuò)配的概率。
　　4.獲取了浙江漢族人群HLA-A、HL