結核分枝桿菌北京基因型菌株的鑒定及分型方法的建立及應用.pdf

1、結核病是一種對人類健康及社會穩(wěn)定構成嚴重威脅的傳染性疾病。中國是22個結核病高負擔國家之一,患病人數(shù)居世界第二位,因此結核病的防治仍是刻不容緩的任務。由于結核病具有潛伏感染的特點,傳統(tǒng)的流行病學方法對于研究結核病的傳播具有很大局限性。分子流行病學是分子生物學與流行病學研究方法相結合產生的新興學科,在研究結核病傳播規(guī)律方面有著不可替代的優(yōu)勢。
　　 結核分枝桿菌中有一類具有相似遺傳背景的北京基因型菌株。這類菌株的分布廣泛,在世界各

2、地都發(fā)現(xiàn)有北京基因型菌株的流行,并造成多次爆發(fā)流行,人們提出北京基因型菌株可能是致病性更強、傳播更迅速以及耐藥形成更容易的一類菌株。目前,根據(jù)北京基因型菌株的定義,需要Spoligotyping分型來鑒定。但是,另一方面,Spoligotyping僅僅作為鑒定北京基因型菌株又顯得過于復雜和繁瑣。2005年,Tsolaki等在對結核分枝桿菌的研究中發(fā)現(xiàn)了一些長序列多態(tài)性位點(large sequence polymorphisms,LSP

3、s),其中RD105是指結核分枝桿菌基因組中的一段缺失區(qū)域(79567-83034bp),在其研究的37株北京基因型菌株中都發(fā)現(xiàn)這段缺失區(qū)域,并提出RD105可以作為北京基因型菌株的分子標志。本研究中,我們通過檢測RD105與北京基因型菌株的相關性,評價其作為分子標志的可行性,在此基礎上建立快速鑒定北京基因型菌株的新方法。
　　 我國主要流行菌株中具有較多的北京基因型菌株,建立適用于北京基因型菌株的結核病的分子流行病學研究方法可

4、以揭示結核病傳播途徑,從而制定有效結核病控制策略來控制結核病傳播。目前廣泛應用IS6110-RFLP對結核分枝桿菌進行基因型分型,是基因型分型的金標準,其分辨率高,但操作復雜,結果分析復雜而困難,使其應用受到很大局限。而Spoligotyping分型方法,相對簡單,但分辨率低,尤其對于北京基因型菌株流行的地區(qū),具有相同Spoligotyping指紋圖譜的北京基因型菌株不能進一步區(qū)分,往往難以達到分型目的。利用基因組DNA上特定位點的數(shù)目

5、可變串連重復序列(variable-number tandem repeat,VNTR)進行基因型分型是在真核生物中常用的方法,它在PCR的基礎上提供的結果是重復序列的數(shù)目,簡單明確,易于比較。近來,VNTR基因分型法越來越受到重視,被認為是研究結核分枝桿菌的分子流行病學及種系進化的有效工具。但是現(xiàn)有的VNTR位點對于中國北京基因型菌株的分辨率有限,因此建立一種簡便、快速、適合中國北京基因型菌株分型的VNTR分型方法顯得尤為重要。現(xiàn)在已

6、經(jīng)有越來越多的研究著重于新的高分辨率位點的研究,但是每種分型方法的評價與研究地區(qū)的樣本密切相關。因此,需要進一步找出新的適合我國菌株分型的VNTR分型方法。本研究通過文獻檢索收集已發(fā)現(xiàn)的49個VNTR位點,以流動人口較少的崇明島收集結核分枝桿菌臨床評估VNTR位點的分辨力,篩選對北京基因型菌株有高分辨力的位點,優(yōu)化了2套VNTR位點組合。
　　 結核病患者在不同的發(fā)病部位或者在同一病程中感染兩種或兩種以上的結核分枝桿菌菌株,稱為

7、多重感染。多重感染的研究對藥敏結果的判斷和治療方案的評價,對結核病的控制策略以及疫苗發(fā)展都有重要意義。VNTR分型可以簡單快速的鑒定結核分枝桿菌多重感染。針對同一病人肺內和肺外不同部位的結核分枝桿菌的多重感染問題,我們對10位病人的肺內及肺外結核菌株,應用建立的VNTR基因分型方法對其進行分析,發(fā)現(xiàn)所有病人的肺內肺外結核菌株都是相同的。本研究應用分子流行病學的方法,研究結核分枝桿菌感染患者的多重感染問題,對結核分枝桿菌的感染及傳播的研究