血小板制品細菌污染核酸檢測方法的建立和評價.pdf

1、近幾年來，隨著輸血引起的病毒感染風險的降低以及濃縮血小板制品(platelet concentrates，PCs)在臨床上的廣泛應用，血小板制品的細菌污染問題受到越來越多學者的關(guān)注。國外研究表明單采血小板的細菌污染率為1:3000，混合血小板的細菌污染率為1:2000，輸注每單位血小板可能產(chǎn)生細菌感染的風險估計是傳播HIV-1、HCV、HBV和HTLV-I/II病毒風險總和的50-250倍。因此，血小板輸注后細菌感染引起敗血癥已成為發(fā)生

2、幾率最高、后果亦相對嚴重的感染性輸血風險。 目前，檢測血小板制品中是否存在細菌污染的方法主要有BacT/Alert 3D全自動細菌培養(yǎng)系統(tǒng)、Pall eBDS及Scansystem檢測系統(tǒng)。其中BacT/Alert 3D全自動細菌培養(yǎng)系統(tǒng)在發(fā)達國家得到了廣泛應用，該系統(tǒng)敏感性高、結(jié)果可靠、操作也相對簡單。然而細菌培養(yǎng)的方法所需檢測時間較長，檢測成本較高，在實際工作中開展仍有一定的困難，故我國目前尚未開展血小板細菌污染的常規(guī)檢測。

3、 近年發(fā)展起來的實時熒光定量PCR技術(shù)憑借其快速、靈敏度高等特點，被國外一些學者引入到血小板制品細菌污染的檢測中來。然而由于缺乏高效、簡便的細菌基因組DNA提取方法及有效控制反應體系中潛在細菌基因組DNA污染的手段，致使核酸檢測技術(shù)對血小板制品進行細菌篩查的方法仍不能有效的應用于臨床。 針對以上問題本研究從抽提方法入手，選取較難裂解的革蘭氏陽性菌-金黃色葡萄球菌作為實驗菌株，分析比較五種經(jīng)典的細菌基因組DNA抽提方法。結(jié)

4、果表明，在五種抽提方法中Chelex-100法抽提效率較高。為進一步提高其抽提效率，本研究對Chelex-100法進行了改良，使其對細菌的最低檢測下限達到0.2CFUs/PCR(相當于10CFUs/ml)。 本研究針對細菌16s rDNA基因保守序列，設計了通用引物進行實時熒光定量PCR擴增，為降低檢測體系中潛在的細菌基因組DNA污染對PCR檢測靈敏度和特異性的影響，本研究對PCR體系進行優(yōu)化，利用Microcon YM-100

5、離心超濾裝置及Ultrafree-MC雙重過濾法有效的在擴增前控制PCR反應體系中潛在的細菌基因組DNA污染，降低了反應背景，使陰性對照Ct值大于34；同時依此方法檢測的最低含菌量組(0.2-0.3CFUs/PCR)Ct值小于30，兩者Ct值相差>4，經(jīng)t檢驗證明兩者結(jié)果有顯著性差異(P<0.001)。因此，可以看出雙重過濾法進一步提高了實時熒光定量PCR檢測的特異性，在降低背景的基礎上提高了檢測的靈敏度。在建立起針對細菌核酸檢測法的基

6、礎上，本研究對該檢測體系的實用性進行了評價。結(jié)果表明，在血小板制品常見污染菌株的檢測中，該檢測體系的靈敏度均達到0.2-0.3CFUs/PCR，其擴增Ct值與陰性對照之間具有顯著差異(P<0.001)。同時與BaeT/ALERT 3D全自動細菌培養(yǎng)系統(tǒng)的平行實驗證明，經(jīng)本研究優(yōu)化的實時熒光定量PCR檢測法結(jié)果可靠，其靈敏度和特異性均為100％，K=1.000。 將該實時熒光定量PCR檢測法應用于917例(470陰性標本與447例

7、陽性標本)臨床標本的檢測中，運用ROC工作曲線對結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)曲線下面積為1.000，表明該檢測方法對陽性標本的檢出率高達100％，且重復性好，具有較高的診斷價值。 除正常情況以外，細菌在外界因素的作用下會發(fā)生細胞壁缺損，同時又保持原有致病性，稱為細菌L型。臨床上出現(xiàn)的許多慢性反復發(fā)作的感染基本上都與細菌L型相關(guān)。由于L型細菌在低滲溶液中易裂解死亡，在普通培養(yǎng)檢測系統(tǒng)中往往發(fā)生漏檢，這對血液安全產(chǎn)生潛在的威脅。為進一步評價本

8、研究建立的實時熒光定量PCR檢測方法對細菌L型的檢測，本研究成功地誘導出金黃色葡萄球菌L型，并使用實時熒光定量PCR法在短時間內(nèi)檢測到L型細菌的存在，提示我們該方法可以有效檢測到血液制品中存在的L型細菌，為血液制品的安全提供更好的保障。 實時熒光定量PCR檢測法無論在操作步驟，檢測時間或檢測靈敏度及特異性上都有很大優(yōu)勢，十分適用于血小板制品發(fā)放前的快速檢測。雖然本研究目前僅限于實驗室研究階段，尚未對大規(guī)模臨床標本檢測的可操作性、