PKM2在腦缺血中后小膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)中的作用.pdf

1、缺血性腦血管疾病(Ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是指包括短暫性腦缺血發(fā)作、腦梗塞和煙霧病在內(nèi)的顱內(nèi)血管病變，其引起的主要病理變化為腦缺血損傷。引起腦缺血損傷的病理生理機制非常復(fù)雜，目前研究主要集中在氧自由基、興奮性氨基酸、細胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應(yīng)和細胞凋亡幾個方面。其中，小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在腦缺血損傷所致的神經(jīng)毒性方面占據(jù)重要地位。
　　PKM2是丙酮酸激酶(Pyuvate kin

2、ase，PK)的一種亞型，是糖酵解過程中最后一步反應(yīng)的限速酶，它能使磷酸烯醇式丙酮酸脫羧生成丙酮酸并產(chǎn)生ATP。PKM2主要表達在胚胎細胞、腫瘤細胞等一些快速分裂增殖的細胞中。目前對于PKM2的研究主要集中在腫瘤細胞中，大量研究表明，PKM2在促進腫瘤細胞的分裂增殖、維持細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)等方面具有重要作用。腫瘤細胞具有特有的Warburg效應(yīng)，即在氧氣充足的情況下葡萄糖還是主要經(jīng)無氧酵解使細胞更多地產(chǎn)生乳酸、一些生物小分子及NADPH

3、，研究表明PKM2在這一過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。當腦組織發(fā)生缺血時，腦組織細胞也會發(fā)生類似腫瘤細胞的代謝過程的改變，但PKM2在缺血性腦血管疾病發(fā)生過程中是否發(fā)揮作用及相關(guān)機制尚未見報道。
　　本課題主要研究PKM2在腦缺血損傷中的作用及相關(guān)作用機制。我們首先利用栓線法制備大鼠大腦中動脈阻塞模型，免疫組化結(jié)果顯示，PKM2在大鼠腦小膠質(zhì)細胞中表達，并在腦缺血后表達升高。進而，我們選用BV-2細胞建立兩種細胞缺氧模型:即利用

4、含250μM CoCl2的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞建立化學(xué)缺氧模型，利用含1％ O2，5％ CO2 and94％ N2的37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞建立物理缺氧模型。Western blot和實時定量PCR結(jié)果顯示，無論在物理缺氧還是化學(xué)缺氧處理的細胞中，PKM2 mRNA表達水平較正常細胞均顯著升高，此外，PKM2與缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的蛋白表達水平在缺氧的誘導(dǎo)下有著一致的高表達趨勢

5、。該結(jié)果提示我們，PKM2在缺氧的小膠質(zhì)細胞中可能發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PKM2和HIF-1α的蛋白表達水平在缺氧的BV-2細胞核中與對照組相比顯著升高，而在細胞漿中無明顯變化。該結(jié)果說明PKM2在缺氧BV-2細胞中的表達升高可能主要與它在核內(nèi)的蛋白激酶的功能有關(guān)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)缺氧BV-2細胞中PKM2的表達升高與HIF-1α的直接調(diào)控相關(guān):首先，我們向BV-2細胞中轉(zhuǎn)染入HIF-1α siRNA，發(fā)現(xiàn)細胞中PKM

6、2的mRNA水平較對照組顯著降低，而轉(zhuǎn)染入HIF-1α的表達質(zhì)粒則顯著升高了PKM2 mRNA水平;其次，為了進一步明確這種調(diào)控機制，我們采用HIF-1α的單克隆抗體進行染色質(zhì)免疫共沉淀實驗，使用針對小鼠PKM2 HRE序列的特異引物對提純的DNA片段進行PCR擴增發(fā)現(xiàn)，HIF-1α是直接結(jié)合在PKM2的HRE序列上的，并且在缺氧誘導(dǎo)下這種結(jié)合增多;最后，為了證明HIF-1α與PKM2 HRE序列的結(jié)合是有功能的，我們構(gòu)建了含有PKM2

7、-HRE序列的報告質(zhì)粒。HEK-293T細胞首先被轉(zhuǎn)染入pGL3-HRE報告質(zhì)粒，然后對細胞進行CoCl2誘導(dǎo)可以增強其熒光素酶活性。此外，向細胞中先后轉(zhuǎn)染HIF-1αsiRNA和pGL3-HRE質(zhì)粒，我們發(fā)現(xiàn)干擾HIF-1α的表達可以明顯降低該位點的轉(zhuǎn)錄活性。綜合以上結(jié)果，我們推斷，當小膠質(zhì)細胞受到缺氧-缺血刺激后，細胞內(nèi)的HIF-1α蛋白更多地與PKM2的HRE基因片段結(jié)合并促進PKM2的轉(zhuǎn)錄。
　　已經(jīng)有文獻報道，人肺癌細胞

8、中升高的活性氧(reactive oxygen species，ROS)可以通過氧化PKM2 Cys358來抑制其催化酶活性使細胞更能對抗ROS毒性。在缺氧的BV-2細胞中，我們觀察到ROS的生成量和炎癥介質(zhì)（IL-1β、IL-6、IL-18和VCAM-1）的轉(zhuǎn)錄水平與正常組相比都明顯升高。在BV-2中轉(zhuǎn)染入PKM2的表達質(zhì)粒可以使這幾種細胞炎癥介質(zhì)mRNA表達水平顯著增加，而與轉(zhuǎn)染PKM2表達質(zhì)粒的細胞相比，轉(zhuǎn)入Cys358位點突變質(zhì)

9、粒的細胞可以中和這種升高。由此，我們可以推斷PKM2在小膠質(zhì)細胞中的促炎作用是通過C358位點的氧化實現(xiàn)的。
　　綜上所述，在缺氧缺血刺激下，小膠質(zhì)細胞中PKM2的表達受到HIF-1α的直接調(diào)控，其表達的上升促進了IL-1β、IL-6、IL-18和VCAM-1的基因轉(zhuǎn)錄，從而影響了細胞內(nèi)的炎癥過程。本研究首次對PKM2在缺氧缺血小膠質(zhì)細胞中的生物學(xué)作用進行了研究，從HIF-1α-PKM2信號通路這一角度為缺血性腦血管疾病的防治提供