檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的酶聯(lián)免疫吸附法及免疫傳感器法的研究.pdf

1、細(xì)菌內(nèi)毒素廣泛存在于空氣、土壤和水等環(huán)境介質(zhì)當(dāng)中，與人體健康密切相關(guān)，一定劑量的內(nèi)毒素在人體免疫功能低下或有創(chuàng)面情況入侵后，機(jī)體本身不會(huì)刺激足夠的體液免疫來(lái)使毒素失效，極微量（1-5ng/公斤體重）的內(nèi)毒素就能導(dǎo)致機(jī)體體溫升高，而后引起的有害癥狀通常包括：致熱反應(yīng)、白細(xì)胞數(shù)目減少、Shwartzman 反應(yīng)、全身炎癥反應(yīng)綜合癥（SIRS）、內(nèi)毒素血癥和低血壓、多臟器功能衰竭綜合癥（MODS）等。
　　 目前，用于細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)

2、方法有：家兔熱原試驗(yàn)法、鱟實(shí)驗(yàn)法、酶聯(lián)免疫測(cè)定法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和生物傳感器等。家兔熱原試驗(yàn)法由于不能定量、耗時(shí)和敏感度不高等缺點(diǎn)有被逐漸淘汰的趨勢(shì)。鱟試驗(yàn)法是目前內(nèi)毒素檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，已被廣泛的應(yīng)用于臨床和環(huán)境中的內(nèi)毒素檢測(cè)，具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高（0.01EU/mL）、易推廣標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。但是一些本身帶有顏色及濁度較高的樣品會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)鱟試劑的制備需要捕殺大量

3、稀有動(dòng)物鱟，因此，尋找鱟試劑的替代方法成為研究的重點(diǎn)。ELISA 由于兼有抗體的高特異性和酶的放大作用而被應(yīng)用于內(nèi)毒素的檢測(cè)，能免于樣品顏色的干擾。缺點(diǎn)在于檢測(cè)精度較鱟試驗(yàn)法低，故在實(shí)際檢測(cè)中應(yīng)用較少。傳感器的特點(diǎn)在于其物理元件測(cè)量速度快、靈敏度高等，能將微小環(huán)境的變化轉(zhuǎn)化為可測(cè)的光電信號(hào)，與具有生物活性物質(zhì)聯(lián)合檢測(cè)內(nèi)毒素是目前傳感器研究的方向。
　　 本文通過(guò)制備出抗內(nèi)毒素的兔多克隆抗體血清，將多粘菌素B（Polymyxin

4、B，PMB）與抗體聯(lián)合建立夾心ELISA（Sandwich ELISA，sELISA）法檢測(cè)內(nèi)毒素，并進(jìn)一步研制出基于PMB 吸附作用的免疫傳感器。
　　 第一部分大腸桿菌內(nèi)毒素多克隆抗體的制備及其在間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA中的應(yīng)用
　　 目的：制備大腸桿菌內(nèi)毒素的兔多克隆抗體；探討ELISA法檢測(cè)大腸桿菌精制內(nèi)毒素的靈敏度；并研究其與細(xì)菌復(fù)合型內(nèi)毒素的反應(yīng)。
　　 方法：將大腸桿菌精制內(nèi)毒素作為免疫抗原免疫家兔，并

5、每周于兔耳緣取少量血制備血清測(cè)其效價(jià)，第五次免疫一周后心臟取血；將一定量的精制內(nèi)毒素包被于96孔板中，再同時(shí)加入定量的抗內(nèi)毒素的兔多克隆抗體和不同濃度的內(nèi)毒素，建立用于檢測(cè)內(nèi)毒素的間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，icELISA)，并優(yōu)化包被用大腸桿菌精制內(nèi)毒素抗原和檢測(cè)用兔多抗的最佳使用濃度；同時(shí)比較兔多抗與羊多抗對(duì)精致型內(nèi)毒素和復(fù)合型內(nèi)

6、毒素的反應(yīng)效果。
　　 結(jié)果：隨著逐次提高免疫劑量免疫家兔后，抗內(nèi)毒素血清的效價(jià)逐漸提高，在第五次免疫后OPD底物顯色效價(jià)達(dá)到1:6400（TMB底物顯色為1:16000）；在包被抗原濃度為100μg/mL和兔多抗使用稀釋比為1:500的最佳使用條件下建立檢測(cè)精制內(nèi)毒素的icELISA，結(jié)果顯示：內(nèi)毒素檢測(cè)范圍在0.1μg/mL～100μg/mL內(nèi)，與O.D值的成反比例關(guān)系，線性范圍回歸方程為：y=-0.1 ln(x)+0.76

7、5，相關(guān)系數(shù)R2為0.982，最低檢測(cè)限為100ng/mL；兔多克隆抗體與羊多克隆抗體均能與大腸桿菌O157:H7菌液內(nèi)的復(fù)合型內(nèi)毒素發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)效價(jià)分別為1:16000與1:32000。
　　 結(jié)論：成功制備出內(nèi)毒素兔抗多克隆抗體，其效價(jià)與國(guó)內(nèi)同類(lèi)抗體效價(jià)相當(dāng)，與國(guó)外商品化的羊多克隆抗體相比較，能與精致型、復(fù)合型內(nèi)毒素（游離型類(lèi)毒素和細(xì)胞結(jié)合型內(nèi)毒素）反應(yīng)，實(shí)用性更為廣。
　　 第二部分多粘菌素B與抗體聯(lián)用的sELI

8、SA 法檢測(cè)內(nèi)毒素
　　 目的：建立多粘菌素B（Polymyxin B，PMB）與抗內(nèi)毒素兔多克隆抗體聯(lián)合的PMB-ET-pAB sELISA 用于內(nèi)毒素的檢測(cè)。
　　 方法：將一定濃度的多粘菌素B 包被于96孔板中，封閉后逐次加入不同濃度的內(nèi)毒素、固定稀釋度的內(nèi)毒素抗血清和酶標(biāo)抗體，顯色后于酶標(biāo)儀A492nm 處檢測(cè)O.D 值；并與使用多克隆抗體建立檢測(cè)內(nèi)毒素的icELISA 相比較。
　　 結(jié)果：PMB-ET

9、-pAB sELISA 法最適條件為PMB10μg/mL、抗內(nèi)毒素抗體稀釋度1:500、HRP 標(biāo)記驢抗兔lgG 稀釋度1：2000。測(cè)精制內(nèi)毒素的結(jié)果顯示：在0.1μg/mL～100μg/mL 范圍內(nèi)，內(nèi)毒素濃度與O.D 值的成正比例關(guān)系，線性范圍回歸方程為：y=-0.094 ln(x)+0.227，相關(guān)系數(shù)R2 為0.914，最低檢測(cè)限為100ng/mL，
　　 結(jié)論：PMB與抗體聯(lián)合建立的PMB-ET-pAB sELISA

10、 成功，且檢測(cè)限與單純使用多抗的sELISA 一致。
　　 第三部分基于多粘菌素B 吸附作用的免疫傳感器
　　 目的：建立基于PMB 吸附作用的新型內(nèi)毒素免疫傳感器。
　　 方法：將一定濃度的PMB固定在已被巰基乙胺和戊二醛修飾的金電極(99.99％，Ф＝4mm）上，封閉后再分別逐次在電極上加入不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、抗內(nèi)毒素兔血清和酶標(biāo)二抗；在底物為添加2μL 30％的雙氧水(H2O2)及含1.0mmol/L

11、對(duì)苯二酚的0.1M pH7.2的PBS 緩沖液中用循環(huán)伏安法檢測(cè)傳感器上辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)催化H2O2還原對(duì)苯二酚底物產(chǎn)生的電流值，分析內(nèi)毒素濃度的改變與還原峰峰電流值大小的關(guān)系。
　　 結(jié)果：免疫傳感器法最適檢測(cè)條件為：PMB 使用濃度 10ug/mL，兔血清稀釋倍數(shù)1:200，酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)1:100；在大腸桿菌精制內(nèi)毒素0.001μg/mL～100μg/mL的濃度范圍內(nèi)