中華大蟾蜍(Bufo bufo gargarigans)生物鐘基因表達及外周激素水平的晝夜節(jié)律研究.pdf

1、目前為止，維持生物鐘運行的確切分子調(diào)控過程仍然不夠清楚，而且存在較大的種屬差異。對分子鐘系統(tǒng)的研究主要集中在嚙齒類和魚類的模式物種，只有少量關(guān)于兩棲類和爬行類的研究。由于兩棲動物是由水生到陸生進化過程中的過渡類群，其在系統(tǒng)發(fā)生學中占有重要位置，因此研究兩棲動物能使我們更深刻地理解脊椎動物的晝夜節(jié)律系統(tǒng)。然而，迄今為止關(guān)于兩棲類生物鐘系統(tǒng)的基本知識還非常缺乏。
　　因此，本研究以中華大蟾蜍為研究對象，克隆了分子鐘系統(tǒng)的核心鐘基因cD

2、NA片段，包括正性調(diào)控元件Clock和Bmal1以及負性調(diào)控元件Cry(Cry1和Cry2)和Per（Per1和Per2），探究該物種在人工授時環(huán)境下生物鐘基因的節(jié)律表達與外周激素水平節(jié)律的關(guān)系。這些激素包括:(1)生物鐘最重要的節(jié)律輸出信號—褪黑素(MT)(2)可反映動物行為和應(yīng)激狀態(tài)的糖皮質(zhì)激素—皮質(zhì)酮(CORT)(3)能夠反映機體代謝水平的甲狀腺激素（T3和T4）。另外，還克隆了甲狀腺激素受體β。
　　主要實驗結(jié)果如下:

3、r>　　(1)中華大蟾蜍在12L∶12D光周期條件下，神經(jīng)視網(wǎng)膜組織的生物鐘基因表達模式:蟾蜍視網(wǎng)膜上的Clock基因的表達呈現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律模式(SE(A)/A＜0.3），雖然Bmal1的表達在統(tǒng)計上未呈現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律模式(SE(A)/A＞0.3）,但其表達模式與Clock類似，兩者峰值出現(xiàn)在ZT4;Per1的表達呈現(xiàn)出顯著的24 h晝夜節(jié)律(SE(A)/A＜0.3），其波峰值出現(xiàn)在黑暗期ZT20，而Per2基因的表達的節(jié)律性在

4、統(tǒng)計上并不顯著(SE(A)/A＞0.3），且與Per1表現(xiàn)出相反的晝夜反應(yīng)模式;Cry1和Cry2基因的表達模式均未呈現(xiàn)出顯著的節(jié)律性(SE(A)/A＞0.3），兩者在黑暗期表達水平要略高于光照期，在趨勢上似乎具有一定的同步性。
　　(2)中華大蟾蜍在12L∶12D光周期條件下，腦組織的生物鐘基因表達模式:蟾蜍腦組織內(nèi)Clock和Bmal1的表達均具有明顯的晝夜節(jié)律(SE(A)/A＜0.3），兩者在光照啟動后4 h(ZT4)同時達

5、到峰值(P＜0.05)，在黑暗期ZT16同時降至谷值(P＜0.05); Per1和Per2表達均呈現(xiàn)出顯著的晝夜節(jié)律(SE(A)/A＜0.3），Cry1表達也具有明顯的晝夜節(jié)律(SE(A)/A＜0.3），但Cry2表達在統(tǒng)計上沒有明顯的晝夜節(jié)律(SE(A)/A＜0.3），腦組織內(nèi)Cry1與Per1、Cry2與Per2的表達呈現(xiàn)出明確的趨同性。
　　(3)中華大蟾蜍血漿中激素水平的晝夜節(jié)律變化:蟾蜍血漿中MT存在一個明顯的24h晝夜

6、節(jié)律(SE(A)/A＜0.3），在黑暗前夕(ZT12)時達到峰值(P＜0.05)，在臨近光照前(ZT24)降至谷值（P＜0.05）;大蟾蜍血漿皮質(zhì)酮水平呈現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律模式(SE(A)/A＜0.3），當光啟動后第4 h(ZT4)血漿皮質(zhì)酮水平達到峰值（P＜0.05），然后在光照結(jié)束前后顯著降低(P＜0.05)，隨后在黑暗期呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(P＞0.05);蟾蜍神經(jīng)視網(wǎng)膜和腦組織內(nèi)THRβ基因mRNA表達在統(tǒng)計上均未呈現(xiàn)出顯著的節(jié)律