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文檔簡(jiǎn)介
1、人和動(dòng)物的生理機(jī)能、生化代謝、行為表現(xiàn)等常以24 h為周期發(fā)生規(guī)律性變動(dòng),這種變化的節(jié)律稱(chēng)為晝夜節(jié)律。產(chǎn)生晝夜節(jié)律的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是分子計(jì)時(shí)器-晝夜節(jié)律生物鐘(circadian clock)。對(duì)于主導(dǎo)節(jié)律調(diào)節(jié)的一些重要基因,稱(chēng)之為生物鐘基因。機(jī)體的各種內(nèi)在晝夜節(jié)律性變化可在外界環(huán)境因素的作用下得到重設(shè)性調(diào)節(jié),以使機(jī)體活動(dòng)與環(huán)境變化達(dá)成和諧統(tǒng)一。
引發(fā)和調(diào)控晝夜節(jié)律生物鐘的分子機(jī)制是在鐘輸入信號(hào)(如光照、溫度等)的作用下,若干鐘
2、基因、鐘相關(guān)基因和鐘控基因及其蛋白產(chǎn)物通過(guò)轉(zhuǎn)錄-翻譯-翻譯后事件的相互銜接,組成鐘振蕩器的自身調(diào)控反饋環(huán)路,實(shí)現(xiàn)鐘信號(hào)的精確輸出。其中作為環(huán)路中正向調(diào)節(jié)成分的核心鐘基因Clock和Bmal1,已被證實(shí)不但24h節(jié)律性表達(dá)于中樞鐘組織如視交叉上核與松果體,而且也表達(dá)于包括血細(xì)胞在內(nèi)的各種外周鐘組織。上述基因產(chǎn)物以雜二聚體形式形成正向轉(zhuǎn)錄因子,與下游鐘基因Per(Period)、Cry(Cryptochromes)或tim(Timeless
3、)啟動(dòng)子區(qū)的E-box元件結(jié)合,激活一系列基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,因此,Clock和Bmal1在生物鐘的分子振蕩機(jī)制中被認(rèn)為起著極其重要的作用。然而,有關(guān)人外周血淋巴細(xì)胞核心鐘基因Clock和Bmal1的晝夜節(jié)律性轉(zhuǎn)錄在南極大陸特殊環(huán)境下有著怎樣的表現(xiàn),至今未明,這正是本文所要探討的內(nèi)容。
目的:
探討赴南極前后科考隊(duì)員外周血淋巴細(xì)胞核心鐘基因Clock和Bmal1的晝夜節(jié)律性表達(dá)規(guī)律,旨在解析、拓展特殊環(huán)境下人類(lèi)
4、外周免疫鐘運(yùn)行的分子調(diào)控機(jī)制。
方法:
8名健康、男性中國(guó)南極科考隊(duì)員志愿者,年齡24~30歲,平均25歲。赴南極前在晝夜節(jié)律模式條件(自然光制,16 h-light:8 h-dark cycle,LD)下生活1周:室溫25±1℃,起床時(shí)間:7:00,睡眠時(shí)間(無(wú)光照期):23:00~7:00,早餐時(shí)間:7:30~8:00,午餐時(shí)間:11:30~12:00,晚餐時(shí)間:5:30~6:00;睡眠時(shí)光照強(qiáng)度<0.1
5、 Lux;受試者自由飲水,無(wú)煙酒嗜好,在過(guò)去6個(gè)月內(nèi)未做過(guò)跨時(shí)區(qū)旅行和未接受過(guò)藥物治療,日常活動(dòng)和飲食成分基本一致。隨后在一晝夜內(nèi),隨機(jī)選擇2位受試者,每隔4 h抽取各自外周血6 ml,血樣采集在4個(gè)不連續(xù)的隨機(jī)晝夜內(nèi)完成。分離其淋巴細(xì)胞,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,測(cè)定不同晝夜時(shí)點(diǎn)(zeitgeber time,ZT,共6個(gè),每個(gè)時(shí)點(diǎn)n=8)每個(gè)樣品中Clock和Bmal1基因的mRNA表達(dá)量,并以熔解
6、曲線(xiàn)和凝膠電泳條帶加以驗(yàn)證,通過(guò)余弦法和ClockLab軟件獲取節(jié)律參數(shù),并經(jīng)振幅F檢驗(yàn)分析是否存在晝夜節(jié)律性表達(dá)。
選取相同8名男性科考隊(duì)員,赴南極后生活一年,經(jīng)歷了極晝與極夜光照差異、季節(jié)與氣候差異、氣溫與氣壓差異等自然環(huán)境變化。其晝夜模式生活條件、采血方式、取樣時(shí)間、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理同上。
結(jié)果:
1.科考隊(duì)員赴南極前外周血淋巴細(xì)胞核心鐘基因Clock和Bmal1的晝夜表達(dá)
7、r> 1.1在LD(16:8)光制下,科考隊(duì)員外周血淋巴細(xì)胞鐘基因Clock和Bmal1的mRNA表達(dá)呈現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律性振蕩(振幅F檢驗(yàn),P<0.05);
1.2 Clock基因的峰值相位-335.85±13.80,表達(dá)振幅3.46±1.27,中值-11.40±1.59,峰時(shí)和谷時(shí)分別位于ZT22和ZT10,峰時(shí)與谷時(shí)mRNA水平分別為-7.95±2.55和-14.85±1.32;
1.3 Bmal1
8、基因的峰值相位-307.12±108.17,表達(dá)振幅2.77±1.11,中值-5.50±1.32,峰時(shí)和谷時(shí)分別位于ZT20和ZT8,峰時(shí)與谷時(shí)mRNA水平分別為-2.74±0.71和-8.25±2.33;
1.4 Clock和Bmal1晝夜節(jié)律性轉(zhuǎn)錄的比較:兩個(gè)基因LD(16:8)光制下在所檢測(cè)的6個(gè)晝夜時(shí)點(diǎn)中表達(dá)水平均有明顯差異(P<0.05),Clock基因的表達(dá)水平較Bmal1基因降低;從晝夜節(jié)律性參數(shù)比較看出,兩
9、個(gè)基因表達(dá)的峰值相位、振幅無(wú)差異(P>0.05),而Clock基因轉(zhuǎn)錄的中值水平以及峰時(shí)mRNA水平和谷時(shí)mRNA水平均降低(P<0.05),Clock峰時(shí)和谷時(shí)比Bmal1推后約2小時(shí)(P<0.05)。
2.科考隊(duì)員赴南極后外周血淋巴細(xì)胞核心鐘基因Clock和Bmal1的晝夜表達(dá)
2.1八名科考隊(duì)員中分別有2人鐘基因Clock、3人Bmal1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)具有明顯的晝夜節(jié)律性(振幅F檢驗(yàn),P<0.05);
10、> 2.2二人Clock基因的峰值相位-42.28±5.27,表達(dá)振幅0.79±0.29,中值-9.02±0.24,峰時(shí)和谷時(shí)分別位于ZT3和ZT15,峰時(shí)與谷時(shí)mRNA水平分別為-8.23±0.53和-9.81±0.05;
2.3三人Bmal1基因的峰值相位-184.58±29.58,表達(dá)振幅1.04±0.65,中值-8.50±0.45,峰時(shí)和谷時(shí)分別位于ZT12和ZT24,峰時(shí)與谷時(shí)mRNA水平分別為-7.46±
11、0.41和-9.54±1.04;
2.4 Clock和Bmal1晝夜節(jié)律性轉(zhuǎn)錄的比較:存在晝夜節(jié)律性表達(dá)的兩個(gè)基因[Clock(n=2)和Bmal1(n=3)]在所檢測(cè)的6個(gè)晝夜時(shí)點(diǎn)(除了ZT14)的表達(dá)水平及其晝夜節(jié)律性參數(shù)變化均無(wú)顯著性差異(P>0.05):
2.5其他隊(duì)員的上述兩個(gè)基因不表現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律性轉(zhuǎn)錄特征(振幅F檢驗(yàn),P>0.05)。這些無(wú)節(jié)律表達(dá)隊(duì)員的Clock基因,除晝夜時(shí)點(diǎn)ZT22以外,
12、在其它各時(shí)點(diǎn)的表達(dá)量均低于Bmal1基因(P<0.05)。
3.科考隊(duì)員赴南極前、后外周血淋巴細(xì)胞核心鐘基因Clock和Bmal1晝夜節(jié)律性轉(zhuǎn)錄的比較
3.1赴南極前、后鐘基因Clock晝夜節(jié)律性表達(dá)的比較:赴南極后的Clock晝夜節(jié)律性表達(dá),與赴南極前相比,除晝夜時(shí)點(diǎn)ZT18和ZT22以外,在其它時(shí)點(diǎn)的表達(dá)量均上調(diào)(P<0.05)。隊(duì)員赴南極后Clock基因的節(jié)律性表達(dá)振幅減小、中值增大、谷時(shí)mRNA水平增
13、大(P<0.05),峰時(shí)和谷時(shí)分別推遲約5個(gè)小時(shí)。
3.2赴南極前、后鐘基因Bmal1晝夜節(jié)律性表達(dá)的比較:赴南極后的Bmal1晝夜節(jié)律性表達(dá),與赴南極前相比,除晝夜時(shí)點(diǎn)ZT10和ZT14以外,在其它時(shí)點(diǎn)的表達(dá)量均下調(diào)(P<0.05)。隊(duì)員赴南極后Bmal1基因的節(jié)律性表達(dá)峰值相位推后,振幅、中值和峰時(shí)mRNA水平均下降(P<0.05),峰時(shí)和谷時(shí)分別推遲約16個(gè)小時(shí)。
結(jié)論:
1.赴南極前,在
14、LD(16:8)自然光制下,科考隊(duì)員外周血淋巴細(xì)胞核心生物鐘基因Clock和Bmal1的轉(zhuǎn)錄具有明顯的晝夜節(jié)律性振蕩特征;Clock轉(zhuǎn)錄的峰時(shí)和谷時(shí)分別位于ZT22和ZT10,Bmal1的峰時(shí)和谷時(shí)分別位于ZT20和ZT8;Clock基因各晝夜時(shí)點(diǎn)的表達(dá)水平、中值以及峰時(shí)mRNA水平和谷時(shí)mRNA水平較Bmal1基因的降低,Clock峰時(shí)和谷時(shí)比Bmal1推后約2小時(shí)。
2.赴南極后,經(jīng)歷各種自然環(huán)境變化,相同8名隊(duì)員中多
15、數(shù)人上述兩個(gè)基因不再表現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律性轉(zhuǎn)錄特征,Clock基因除晝夜時(shí)點(diǎn)ZT22以外,在其它各時(shí)點(diǎn)的表達(dá)量均低于Bmal1基因。
3.赴南極后,2人Clock基因、3人Bmal1基因的轉(zhuǎn)錄繼續(xù)維持明顯的晝夜節(jié)律性表達(dá),其中Clock轉(zhuǎn)錄的峰時(shí)和谷時(shí)分別位于ZT3和ZT15,Bmal1的峰時(shí)和谷時(shí)分別位于ZT12和ZT24;兩個(gè)基因在所檢測(cè)的6個(gè)晝夜時(shí)點(diǎn)(ZT14除外)的表達(dá)水平及其晝夜節(jié)律性參數(shù)的相應(yīng)變化基本一致。
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