黑斑蛙和中華大蟾蜍AQPs基因克隆及組織表達研究.pdf

1、水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）是存在于細胞膜上的一種跨膜蛋白家族，與水分子的快速轉運有關，在滲透壓的作用下，具有增加細胞膜水通透性的功能，在維持生物體體內水分的動態(tài)平衡方面發(fā)揮著關鍵的作用。故對AQPs進行基因克隆以及在不同組織中的表達分析，來推測其在不同組織中的生理學作用，進而預測它們在脊椎動物滲透壓調節(jié)和通過體表水分蒸發(fā)體溫調節(jié)中的作用，為闡明其新的生物學功能奠定理論基礎。 兩棲動物和哺乳動物AQP的系統(tǒng)進化樹

2、表明：無尾目動物AQPs可以分為六種聚類：即1、2、3、5和無尾目動物特異性的a1和a2（字母“a”代表anuran）。本試驗應用RT-PCR方法從黑斑蛙（R.ana nigromaculat）和中華大蟾蜍（Bofu gargarizans）的不同組織中擴增獲得AQP1、AQP3、AQP5、和看家基因β-actin、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3phosphate dehydrogenase，GAPDH）以及黑

3、斑蛙的AQPa2的部分編碼序列；并通過半定量RT-PCR分析了AQP1基因mRNA在黑斑蛙和中華大蟾蜍不同組織中的表達情況。 具體研究內容包括： （1）在Genbank中查找非洲爪蟾（Xenopus tropicalis）、灰樹蛙（Hyla chrysoscelis）、日本樹蛙（Hyla japonica）等物種的AQP1、AQP3、AQP5、AQPa2基因和看家基因β-actin、GAPDH序列，并根據其編碼區(qū)設計引物

4、；提取黑斑蛙和中華大蟾蜍不同組織的總RNA，采用RT-PCR技術分別擴增黑斑蛙AQPA、AQP3、AQP5、AQPa2和看家基因β-actin、GAPDH的部分序列，以及中華大蟾蜍AQP1、AQP3、AQP5和看家基因β-actin、GAPDH的部分序列，將此片段與PMD18-T載體連接，轉化到感受態(tài)細胞中，進行藍白斑篩選以及陽性克隆鑒定后測序。 （2）以β-actin為內參基因，應用RT-PCR方法檢測AQP1在黑斑蛙和中華大

5、蟾蜍不同組織中的表達情況。 研究結果顯示： （1）將測序結果在GeneBank上進行序列相似性搜索，發(fā)現試驗中所克隆的兩種兩棲動物的11條基因序列分別對應于不同物種中的AQP1、AQP3、AQP5、AQPa2、GAPDH和β-actin基因片段，此結果證實，所克隆的序列分別為黑斑蛙AQPA、AQP3、AQP5、AQPa2、β-actin和GAPDH的部分cDNA序列，以及中華大蟾蜍的AQP1、AQP3、AQP5、β-ac

6、tin和GAPDH的部分cDNA序列。利用DNAMAN軟件推導出所得基因片段的氨基酸序列，與其他物種相應氨基酸序列進行同源性分析，結果表明：黑斑蛙與食用蛙（Rana esculenta chip）AQPA的氨基酸相似性最高為97.6％，遺傳距離最??；而中華大蟾蜍AQP1的氨基酸序列與其他物種的相似性較低。黑斑蛙與灰樹蛙、日本樹蛙的AQP3氨基酸序列相似性最高，均為96.9％，遺傳距離最?。恢腥A大蟾蜍和灰樹蛙、日本樹蛙的AQP3氨基酸序列

7、相似性最高，均為91.9％，遺傳距離最小，并且與黑斑蛙AQP3的氨基酸序列同源性為90.7％。中華大蟾蜍和黑斑蛙與美洲巨蟾蜍（Bufo marinus）的AQP5氨基酸序列相似性較高，均為95.9％，遺傳距離較小；黑斑蛙的AQPa2與美洲巨蟾蜍AQP-t3和美洲巨蟾蜍AQP-t2以及日本樹蛙AQP-h3和日本樹蛙AQP-h2氨基酸序列具有較高的同源性，相似性分別為83.7％、66.3％、83.2％和66.3％。系統(tǒng)發(fā)育分析表明：兩棲動物

8、的AQP可以分為6個聚類，聚類結果與形態(tài)學特征和傳統(tǒng)分類學中的進化地位是基本一致的；其中黑斑蛙和中華大蟾蜍AQP1、AQP3和AQP5與哺乳動物相對應的基因為同一亞族。 （2）AQP1組織分布的半定量RT-PCR研究結果顯示：AQPA在黑斑蛙的膀胱、背部皮膚、腹部骨盆皮膚、腹部皮膚、腦和腎臟中均有表達；AQP1在中華大蟾蜍的膀胱、背部皮膚、腹部骨盆皮膚、腹部皮膚、肺和腎臟中均有表達。凝膠電泳條帶灰度分析的結果表明：AQPA基因在